1.1. Лабораторная диагностика классической чумы свиней заключается в обнаружении в патологическом материале специфического антигена методом иммунофлуоресценции, реакции связывания комплемента (РСК), а также в постановке биологической пробы.

1.2. Лабораторный диагноз на классическую чуму свиней ставят на основании получения положительных результатов ИФ и РСК.

Окончательный диагноз устанавливается на основании эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с учетом результатов лабораторного исследования.

1.3. Для лабораторной диагностики КЧС в лабораторию направляют патологический материал (кусочки печени, селезенки, подчелюстных, мезентеральных лимфоузлов), взятый от вынужденно убитых в агональном состоянии животных, у которых в течение 4...5 дней отмечалось повышение температуры тела. Патологический материал в свежем или замороженном состоянии доставляют в лабораторию. Его можно хранить в замороженном состоянии в течение 8...10 дней, материал от павших животных к исследованию не пригоден.

1.4. Метод иммунофлуоресценции и реакцию связывания комплемента для обнаружения специфического антигена в патологическом материале применяют при исследовании материала от невакцинированных свиней или от свиней, привитых вирус-вакциной против чумы за 30 и более дней до вынужденного убоя. В связи с этим в сопроводительной описи к патологическому материалу указывают дату последней вакцинации свиней.

2.1. Индикация антигена проводится с помощью реакции ИФ (прямой вариант и с применением контрастирующего красителя). Из патологического материала готовят мазки-отпечатки или гистологические срезы. Препараты подсушивают на воздухе и фиксируют метиловым спиртом в течение 3...4 мин при комнатной температуре или смесью (1:1) метилового спирта и ацетона, предварительно охлажденной до -10...-20 °C.

2.2. Прямой вариант метода ИФ. Флуоресцирующую сыворотку разводят растворителем или забуференным физиологическим раствором до рабочего титра и наносят на препараты, которые помещают во влажную камеру (чашка Петри с увлажненным дном) при 37 °C на 30 мин. Затем препараты промывают забуференным физиологическим раствором, подсушивают, наносят забуференный глицерин, покрывают покровным стеклом и исследуют под люминесцентным микроскопом, используя объектив 90, окуляр 5, светофильтры ЗС7-2, ФС8-2, ФС1-2.

2.2.1. Оценка результатов. ИФ считается положительной при наличии в препаратах округлых клеток с ярко-зеленым свечением цитоплазмы или цитоплазмы и ядра. Специфическое свечение должно быть обнаружено в препарате не менее чем в трех полях зрения при наличии в каждом из них 3...5 и более светящихся клеток.

Не учитывают свечения дегенеративно измененных клеток и лейкоцитов, которые отличают по структуре ядра и выраженной гранулярной флуоресценции цитоплазмы.

2.2.2. Для контроля специфичности свечения наносят на препараты специфическую к вирусу сыворотку с последующей окраской флуоресцирующей сывороткой, а также окрашивают препараты нормальной меченой сывороткой. В контрольных препаратах свечение не отмечается.

2.3. Реакция ИФ с применением контрастирующего красителя. На препараты наносят смесь флуоресцирующей сыворотки и раствора Эванса голубого (3 части сыворотки и 1 часть 0,25%-ного раствора синьки Эванса) и выдерживают при комнатной температуре во влажной камере в течение 10...12 ч. Затем препарат погружают в подогретый до 60...70 °C 20%-ный раствор триэтиленгликоля на 30...90 с до появления нежно-голубого оттенка, промывают, подсушивают, заключают в забуференный глицерин под покровное стекло и просматривают под люминесцентным микроскопом.

2.3.1. Оценка результатов. Реакция ИФ считается положительной, если на оранжево-красном фоне препарата наблюдается светло-зеленое свечение цитоплазмы. Контрольные препараты дают красное свечение. Некротические участки ткани, клеточный детрит светятся зеленовато-желтым цветом, но они отличаются от специфического свечения отсутствием у них клеточной структуры.

2.4. Реакция связывания комплемента. Для обнаружения в патологическом материале КС-антигена готовят из растертых в ступке органов 20%-ную суспензию на забуференном физиологическом растворе с pH 7. Суспензию экстрагируют при комнатной температуре в течение 2 ч, затем трехкратно замораживают при температуре -20 °C, центрифугируют при 5000 об/мин в течение 20 мин. Надосадочную жидкость вновь центрифугируют при 10 000...15 000 об/мин в течение 30 мин. Полученную надосадочную жидкость используют в РСК как испытуемый антиген.

2.4.1. Титрование гемолизина. Для титрования готовят основное разведение гемолизина 1:100 (0,2 мл гемолизина и 9,8 мл физиологического раствора), а затем готовят все последующие разведения по схеме 1.

Примечание: 0 - полный гемолиз; ++ - частичная задержка гемолиза (50%); ++++ - полная задержка гемолиза.

Гемолизин титруют по схеме 2.

Титром гемолизина считают наивысшее разведение, дающее полный гемолиз эритроцитов. Рабочее разведение гемолизина соответствует четырехкратному титру. Например, если титр гемолизина 1:1200, то рабочее разведение будет равно 1:300 (по схеме 2).

2.4.2. При определении рабочей дозы комплемента его применяют в разведении 1:10 в дозах 0,04; 0,06; 0,08; 0,1; 0,12; 0,14; 0,16; 0,18.

В каждую пробирку добавляют недостающее количество физиологического раствора до конечного объема 0,2 мл. Для удобства приготовления доз комплемента готовят вспомогательный ряд пробирок, в которых увеличивают количество комплемента в 10 раз (схема 3).

Содержимое каждой пробирки в объеме 0,1 мл добавляют в пробирки, в которые предварительно разлиты по 0,1 мл специфические, испытуемые и контрольные антигены и сыворотки (каждый компонент в отдельный ряд пробирок) и по 0,1 мл физиологического раствора.

При титровании комплемента в присутствии гемолизина в пробирки предварительно добавляют по 0,2 мл только физиологического раствора.

После добавления комплемента во все пробирки вносят по 0,2 мл сенсибилизированной гемолитической системы (равные объемы 3%-ной взвеси эритроцитов крупного рогатого скота и гемолитической сыворотки кроликов, взятой в четырехкратном титре) и смеси инкубируют при температуре 37 °C.

2.4.3. Результаты учитывают через 30 мин по примерной схеме 4.

2.4.4. В примере, приведенном в схеме 4, одна доза комплемента составляет 0,08 мл его разведения 1:10. В основном опыте используют рабочие дозы, равные 1,2 и 1,5. Затем рассчитывают количество комплемента для всего опыта следующим образом: если доза соответствует 0,08 мл разведения комплемента 1:10, то 1,2 дозы будут равны

Полученное число умножают на количество пробирок в опыте, увеличенное на 10...20% (лучше брать с увеличением на 10...20 пробирок). Например, на 100 пробирок это составит

Так как общий объем комплемента на 100 пробирок должен быть 100·0,1 = 10 мл, то к полученному числу неразведенного комплемента добавляют 9,04 мл физиологического раствора. Аналогичным методом высчитывают 1,5 дозы комплемента.

2.4.5. Постановка главного опыта РСК. Реакцию ставят в объеме 0,5 мл. Первую фазу реакции (фазу связывания комплемента) проводят при 4...8 °C в течение 16...18 ч; вторая фаза (фаза выявления) проходит на водяной бане при температуре 37...38 °C в течение 30...40 мин (до наступления полного гемолиза эритроцитов в контрольных пробирках).

Разведение компонентов реакции готовят на 0,85%-ном физиологическом растворе. Сыворотки используют в реакции без инактивации.

Для обнаружения антигена классической чумы свиней используют специфическую сыворотку к вирусу этой болезни. В качестве контролей используют специфический и нормальный (отрицательный) антигены в рабочих разведениях.

Двукратные разведения испытуемых и контрольных антигенов разливают по 0,1 мл в три ряда пробирок (по 5 в каждом ряду). Затем в пробирки одного ряда добавляют специфическую, а в пробирки другого ряда - нормальную сыворотку по 0,1 мл. В третий ряд пробирок вместо сыворотки наливают по 0,1 мл физиологического раствора. Затем во все пробирки добавляют по 0,1 мл комплемента (1,2 в рабочей дозе). Параллельно ставят необходимые контроли (см. схемы 5, 6).

После проведения фазы связывания комплемента при температуре 4...8 °C в течение 18...20 ч добавляют гемолитическую систему по 0,2 мл и выдерживают на водяной бане при температуре 37...38 °C до наступления полного гемолиза в контрольных пробирках (30...40 мин).

Положительным результатом РСК считают полную задержку гемолиза (++++) или задержку его на три креста (+++) испытуемым антигеном в присутствии специфической сыворотки при полном гемолизе в ряду с нормальной сывороткой.

Сомнительным результатом РСК считают задержку гемолиза испытуемым антигеном в присутствии специфической сыворотки на два (++) креста. При получении сомнительного результата реакцию ставят повторно. При получении дважды сомнительных результатов реакция считается положительной.

3.1. Биопробу проводят для подтверждения диагноза.

3.2. В каждом отдельном случае на проведение биопробы необходимо иметь разрешение ветеринарного отдела областного (краевого) управления сельского хозяйства, министерства сельского хозяйства автономной республики или главного управления ветеринарии министерства сельского хозяйства союзной республики, не имеющей областного деления.

3.3. Биопробу проводят под методическим руководством областной (краевой, республиканской) ветеринарной лаборатории в условиях, исключающих возможность рассеивания инфекции и спонтанного заражения опытных свиней.

3.4. Для биопробы отбирают две группы животных: 1-я группа - три подсвинка из благополучного хозяйства, где животные не вакцинировались против чумы в течение последних двух лет; 2-я группа - три подсвинка, вакцинированные против чумы за 30 и более дней до постановки на них биопробы.

3.5. В качестве материала для заражения используют 10%-ную суспензию на физиологическом растворе из органов вынужденно убитых больных животных. В суспензию добавляют антибиотики (пенициллин и стрептомицин по 1000 ЕД/мл), выдерживают при температура 2...4 °C в течение 3 ч, затем дважды ее центрифугируют (первый раз при 3000 об/мин в течение 30 мин, второй - при 8000...10 000 об/мин в течение 1 ч). Надосадочной жидкостью заражают подсвинков 1-й и 2-й групп (неиммунных и иммунных к вирусу чумы), внутримышечно в объеме 10 мл. За подопытными животными наблюдают в течение 21 дня.

3.6. Биопробу считают положительной, если все неиммунные подсвинки (1-я группа) после введения патологического материала заболели и пали, а иммунные (2-я группа) остались здоровыми.

Материал от вынужденно убитых животных биопробы в случае необходимости исследуют в РСК и методом ИФ с целью обнаружения в нем антигена вируса классической чумы свиней.

С утверждением настоящих Методических указаний утрачивает свою силу Временное наставление по лабораторной диагностике чумы свиней методом иммунофлуоресценции от 29 января 1971 г.