1.1. Лабораторная диагностика вирусного энтерита гусят заключается: в выделении вируса в гусиных эмбрионах (ГЭ) или культуре клеток гусиных фибробластов (ГФ); в идентификации вируса в реакции нейтрализации (РН) в культуре клеток ГФ или в реакции диффузионной преципитации (РДП).

1.2. Диагноз на вирусный энтерит гусят устанавливают на основании результатов лабораторного исследования, эпизоотологических данных, клинических признаков и патологоанатомических изменений.

1.3. Для постановки диагноза с учетом выделения вируса и его идентификации в РДП и РН требуется 14 ... 22 дня.

2.1. В ветеринарную лабораторию направляют 5 ... 6 свежих трупов гусят, помещенных в целлофановые пакеты и термос со льдом. В лаборатории при вскрытии гусят отбирают кусочки печени, селезенки, почек, головного мозга, сердца, а также носовую слизь и кусочки двенадцатиперстной кишки (последние помещают в отдельную посуду).

2.2. Кусочки внутренних органов растирают в ступке и готовят из них 10%-ную суспензию на физиологическом растворе. Суспензию центрифугируют при 1 ... 3 тыс. об/мин 10 ... 15 мин. После этого надосадочную жидкость отсасывают пипеткой в пробирку, в которую добавляют 200 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, затем выдерживают эту смесь 30 ... 40 мин при комнатной температуре и делают посевы на МПА, МПБ и среду Китта-Тароцци.

При использовании внутренних органов, носовой слизи и кишечника для выделения вируса суспензию фильтруют через фильтр Зейтца СФ или добавляют к ней равный объем х.ч. хлороформа, затем шуттелируют и центрифугируют при 3 тыс. об/мин по 15 мин. Для заражения ГЭ берут фильтрат или надосадочную жидкость.

3.1. Для выделения вируса используют ГЭ из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням гусей.

3.2. Фильтрат или жидкость, обработанную антибиотиками или хлороформом, вводят не менее 6 ГЭ 10 ... 12-дневного возраста и одновременно для исключения других вирусов (ньюкаслской болезни, вируса гепатита, реовирусов) 6 куриным эмбрионам (КЭ) 8 ... 9-дневной инкубации. Эмбрионы помещают в термостат при температуре 37,5 °C, затем их овоскопируют ежедневно и отбирают павших.

В положительном случае у павших на 3 ... 4-е сут ГЭ обнаруживают гиперемию, кровоизлияния в коже, отек тельца, у павших через 5 сут и более - отставание в росте, отек затылочной части головы, подчелюстного пространства, шеи, гиперемию крыльев, гиперемию и отек конечностей, у некоторых - кровоизлияние в мозг, дистрофию сердечной мышцы, уплотнение печени, увеличение и гиперемию почек.

Возбудитель вирусного энтерита гусей не вызывает гибели КЭ.

3.3. Вируссодержащую амнионаллантоисную жидкость павших ГЭ контролируют в реакции гемагглютинации (РГА) с эритроцитами кур. Вирус энтерита гусят не агглютинирует их.

3.4. Для исключения коли-паратифозной микрофлоры, которая может вызвать гибель зараженных ГЭ в первые дни, амнионаллантоисную жидкость исследуют бактериологически.

4.1. Испытуемый вируссодержащий материал (суспензию из кусочков органов с антибиотиками, фильтрат или вируссодержащую амнионаллантоисную жидкость ГЭ) вносят на монослой ГФ или суспензию их, полученных путем трипсинизации ГЭ 14-дневной инкубации.

Зараженные ГФ инкубируют в термостате при температуре 37,5 °C в течение 7 сут с ежедневным просмотром под малым увеличением микроскопа. В положительном случае на 5 ... 6-й день наступает ЦПД в виде округления клеток и отторжения их от стекла. В отдельных случаях проводят 2 ... 3 слепых пассажа.

4.2. Адаптированный к культуре ГФ вирус идентифицируют в РН по методу: постоянная доза вируса 1000 ТЦД₅₀ + двукратные разведения специфической сыворотки кролика против вируса энтерита гусят.

4.3. Для постановки РН необходимы следующие компоненты: испытуемый вирус, адаптированный в культуре ГФ (антиген); специфическая кроличья сыворотка; нормальная кроличья сыворотка.

4.4. Перед постановкой реакции нейтрализации определяют титр вируса (ТЦД₅₀), для чего каждым его десятикратным разведением в объеме 0,1 мл заражают по 4 пробирки монослоя ГФ и инкубируют его в термостате при температуре 37,5 °C в течение 5 ... 7 сут. Титр вируса вычисляют по методу Рида и Менча.

Специфическую и нормальную кроличьи сыворотки инактивируют на водяной бане при температуре 56 °C в течение 30 мин, а затем из каждой готовят двукратные разведения 1:5, 1:10, 1:20 на 0,5%-ном растворе гидролизата лактальбумина. В качестве антигена в каждую пробирку вносят вирус, содержащий 2·10^-3 ТЦД₅₀/мл, чтобы в смеси с сывороткой находилось 10^-3 ТЦД₅₀/мл.

После добавления вируса в равном объеме к разведению сыворотки смесь встряхивают и на 1 ч ставят в термостат при температуре 37,5 °C, после чего каждой смесью по 0,2 мл заражают по 4 пробирки монослоя ГФ или суспензию клеток и инкубируют их при температуре 37,5 °C.

4.5. Для оценки РН ежедневно проводят микроскопию зараженной культуры под малым увеличением микроскопа. О положительном результате свидетельствует отсутствие ЦПД на 5 ... 6-й день в пробирках со специфической сывороткой в разведениях 1:10 и более и наличие ЦПД с нормальной сывороткой в разведении 1:10.

5.1. Для обнаружения и идентификации вируса в РДП требуются следующие компоненты: 1%-ный агар на 0,8%-ном растворе хлористого натра; специфическая кроличья сыворотка к вирусу энтерита гусят; исследуемый материал - амнионаллантоисная жидкость павших ГЭ после их заражения, суспензия из кусочков внутренних органов больных или павших гусят или эта же суспензия, обработанная хлороформом; нормальная кроличья сыворотка; амнионаллантоисная жидкость незараженных гусиных эмбрионов или суспензия из кусочков органов здоровых гусят.

5.2. Агаровую среду готовят по прописи: агар "Дифко" - 1 г, хлористый натрий - 8 г, вода дистиллированная - 100 мл. Смесь автоклавируют при 1 атм в течение 30 мин, затем фильтруют через 2 слоя марли и доводят pH смеси до 7,2 ... 7,4 10%-ным раствором едкого натра. Среду консервируют мертиолятом (0,01% к общему объему) и хранят при температуре 4 °C 12 ... 14 сут.

Перед постановкой реакции агар расплавляют и разливают тонким слоем (2 ... 3 мм) в чашки Петри или на обезжиренные предметные стекла. В слое застывшего агара при помощи штампа нарезают лунки.

5.3. Постановку реакции осуществляют следующим образом: в центральную лунку вносят 0,2 мл специфической кроличьей сыворотки против вирусного энтерита гусей, а в периферические - через одну по 0,2 мл исследуемые суспензии из тканей органов (необработанные или обработанные хлороформом) или амнионаллантоисные жидкости павших гусиных эмбрионов.

В качестве контроля служат специфическая кроличья сыворотка против вирусного энтерита гусей с отрицательным антигеном амнионаллантоисной жидкости незараженных гусиных эмбрионов или суспензией из тканей органов здоровых гусят и испытуемый вируссодержащий материал с нормальной кроличьей сывороткой.

5.4. Чашки Петри или предметные стекла помещают во влажную камеру и выдерживают 18 ... 24 ч при температуре 37,5 °C.

5.5. Учет реакции производят через 18 ... 24 ч.

Реакцию считают положительной при наличии четко выраженных полос преципитации между лунками с испытуемым антигеном и специфической сывороткой и отсутствии полос между специфической сывороткой и антигеном из амнионаллантоисной жидкости незараженных гусиных эмбрионов или суспензии органов здоровых гусят и между испытуемым материалом с нормальной кроличьей сывороткой (1).