1.1. Оспа - контагиозная болезнь животных, протекающая с признаками аутоинтоксикации, лихорадки и узелково-пустулезной сыпи на коже (экзантемы) и на слизистых оболочках (энантемы), проходящей определенные стадии формирования: розеола - везикула - папула - пустула - струп.

1.2. Оспа у разных видов животных вызывается следующими вирусами:

- крупный рогатый скот - оспы коров или осповакцины;

- овцы - оспы овец;

- козы - оспы коз;

- свиньи - оспы свиней, оспы коров или осповакцины;

- верблюды - оспы верблюдов, оспы коров или осповакцины.

1.3. Лабораторная диагностика оспы животных включает в себя:

- обнаружение в патологическом материале оспенных частиц (вирионов) методом вирусоскопии;

- обнаружение цитоплазматических ацидофильных включений в пораженных участках кожи больного или зараженного животного гистологическим методом;

- выделение вируса на куриных эмбрионах (КЭ) с последующей его идентификацией;

- биологическую пробу (в сомнительных случаях) на естественновосприимчивых животных.

2.1. Патологический материал отбирают не менее чем с 5 участков пораженной кожи. Для сбора и консервирования материала используют стерильные инструменты, посуду и консервирующие растворы.

Материал от больных животных, обработанных моющими или дезинфицирующими растворами (едкого натра и др.), к исследованию не пригоден.

2.2. Для исследования в лабораторию направляют:

- мазки, сделанные из содержимого везикул больного животного, и мазки-отпечатки с оспенных поражений кожи;

- патологический материал от больных животных (содержимое везикул, целые папулы и пустулы, иссеченные вместе с субэпидермальной отечной тканью).

2.3. Мазки высушивают на воздухе, складывая так, чтобы они не соприкасались между собой, и упаковывают в целлофан.

2.4. Везикулярную жидкость собирают в капилляры пастеровских пипеток, которые затем помещают в пробирки с резиновыми пробками.

2.5. Папулы и пустулы иссекают ножницами вместе с отечной тканью и помещают в два стерильных флакона: один - с 50%-ным раствором глицерина, второй - с 10%-ным раствором формалина.

2.6. Отобранный материал (пробирки и флаконы с патологическим материалом предварительно обрабатывают снаружи 3%-ным раствором хлорамина) упаковывают в металлические коробки или пеналы и направляют с нарочным в лабораторию. Неконсервированный материал доставляют в термосе со льдом в день отбора.

3.1. Для обнаружения вирусных оспенных частиц (вирионов) исследуют мазки и мазки-отпечатки из патологического материала окрашенные по методу Морозова или Пашена (см. приложение 1).

При микроскопии в препаратах обнаруживают множество мелких частиц кокковидной формы, расположенных поодиночке, парами или в виде скоплений. При окраске по Морозову оспенные частицы имеют темно-коричневый цвет, по Пашену - темно-красный.

3.2. Результат исследования считают положительным только при обнаружении вирионов в массовом количестве (в виде россыпей). При отрицательном результате вирусоскопического исследования, а также при обнаружении единичных вирионов проводят дальнейшие исследования.

4.1. Из фиксированных формалином проб кожи на замораживающем микротоме готовят срезы, которые окрашивают гематоксилин-эозином.

4.2. При исследовании папул в дерме находят гиперемию, серозный отек и клеточный пролиферат, состоящий из лейкоцитов, гистиоцитов (макрофагов) и фибробластов, в эпидермисе - гиперплазию и некроз кератоцитов.

В везикулах обнаруживают скопление серозного экссудата или полиморфноядерных лейкоцитов, лизис клеток дермы, в пустулах - наличие гнойных телец.

При оспе в эпителиальных клетках эпидермиса, а у овец и коз также в гистиоцитах сосочкового слоя дермы находят цитоплазматические ацидофильные включения.

4.3. Патологогистологический диагноз на оспу свиней и оспу овец считают положительным при обнаружении, кроме вышеописанных изменений (п. 4.2), внутриядерных вакуолей в кератиноцитах эпидермиса кожи свиней и соответственно, в гистиоцитах собственно кожи (дермы) овец.

4.4. Оспу овец дифференцируют от контагиозного пустулезного дерматита, при котором устанавливают гиперкератоз, пролиферацию эпителия волосяных фолликулов, а также ацидофильные цитоплазматические изменения в кератиноцитах эпидермиса.

5.1. Пробы исследуемого материала растирают в ступке и готовят 10%-ную суспензию на физиологическом растворе (pH 7,2...7,4).

Если патматериал консервирован глицерином, его предварительно отмывают физиологическим раствором.

Суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отсасывают, добавляют к ней антибиотики (из расчета 500 ЕД/мл пенициллина, 250 мкг/мл стрептомицина и 50 ЕД/мл нистатина); выдерживают при 4 °C 12 ч. Надосадочную жидкость проверяют на бактериальную загрязненность. При отсутствии в течение суток роста микрофлоры в МПБ и на МПА ее используют для заражения куриных эмбрионов.

5.2. Выделение вируса оспы коров и осповакцины проводят на куриных эмбрионах 11...12-дневного возраста. Для заражения их используют надосадочную жидкость в разведениях 1:10 (исходное разведение), 1:100 и 1:1000.

Перед заражением КЭ овоскопируют, отмечают пугу (воздушный мешок) и бессосудистую зону на боковой поверхности хорионаллантоисной оболочки (ХАО). Затем эмбрионы обрабатывают спиртом с содержанием 0,1% настойки йода и фламбируют.

Для заражения эмбриона в скорлупе пробойником делают отверстия в центре пуги и сбоку в бессосудистой зоне. Через боковое отверстие на ХАО вводят по 0,2 мл надосадочной жидкости в разведении 1:10, 1:100 и 1:1000 (по 4 эмбриона на каждое разведение). После введения исследуемую жидкость равномерно распределяют на ХАО осторожным покачиванием яйца. Затем отверстия в скорлупе заклеивают лейкопластырем, яйца укладывают на бок вверх заклеенным отверстием. Для контроля оставляют незараженными 4 КЭ.

5.3. Эмбрионы инкубируют при 34,5...35 °C в течение 5 сут, ежедневно просматривая. Гибель эмбрионов в первые сутки считают неспецифической. Эмбрионы, погибшие в более поздние сроки, отбирают, охлаждают и вскрывают. По истечении пяти суток инкубации вскрывают все оставшиеся эмбрионы.

5.4. Вскрытие КЭ проводят в стерильных условиях. Пинцетом в месте заражения удаляют скорлупу и глазными ножницами иссекают всю пораженную часть ХАО, которую затем промывают в физиологическом растворе, помещают в чашку Петри и просматривают с помощью лупы на черном фоне на наличие оспенных поражений.

5.5. При наличии в патматериале вируса осповакцины к 72-му часу после заражения на ХАО образуются плоские беловатого цвета оспины диаметром 3...4 мм. Вирус оспы коров образует сходные поражения, но отличающиеся резко геморрагическим характером ("красные оспины"), однако отдельные оспины (1...3%) могут быть беловатого цвета.

Из пораженных участков ХАО делают мазки для обнаружения частиц вируса оспы методом серебрения по Морозову или окраски по Пашену (п. 3).

При отсутствии специфических поражений на ХАО, суспензией из ХАО делают второй пассаж на КЭ.

5.6. Вирусы оспы овец, коз, свиней, верблюдов на ХАО не вызывают образования специфических изменений.

6.1. Биологическую пробу проводят на лабораторных или естественновосприимчивых животных, взятых из благополучных по инфекционным болезням хозяйств.

6.2. Дифференциацию вируса осповакцины от вируса оспы коров проводят постановкой биопробы на цыплятах, белых мышах или кроликах.

6.2.1. Биопроба на цыплятах: у 1,5-месячных цыплят в области голени удаляют перья; в свежеобнаженные фолликулы голени одной конечности (вторая - для контроля) стерильным шпателем втирают 0,6 мл исследуемой надосадочной жидкости (п. 5.1) или суспензии из пораженной ХАО, в которые предварительно добавляют 20% стерильного глицерина.

Вирус осповакцины вызывает образование у цыплят на 7...9-й день после заражения доброкачественного оспенного фолликулита; вирус оспы коров специфических изменений не вызывает.

6.2.2. Биопроба на белых мышах: пяти белым мышам массой 15...18 г вводят внутримышечно по 0,2 мл надосадочной жидкости исследуемой суспензии (п. 5.1).

Вирус осповакцины гибели мышей не вызывает; вирус оспы коров вызывает гибель мышей на 5...7-й день после заражения.

6.2.3. Биопроба на кроликах: у двух кроликов массой тела 1,5...2 кг на 4 участках в области живота выстригают шерсть на площади 2,5x2,5 см; кожу обрабатывают 70°-ным этиловым спиртом и острым концом стерильного скальпеля делают насечки длиной по 1 см, избегая появления капель крови. В скарифицированную кожу втирают стерильным шпателем по 0,2 мл (на каждый участок) надосадочной жидкости исследуемой суспензии. В суспензию предварительно добавляют 20% глицерина.

Вирус осповакцины на 3...5-й день после заражения вызывает у подопытных кроликов на скарифицированных участках кожи образование инфильтратов без геморрагии; вирус оспы коров вызывает образование геморрагических инфильтратов.

6.3. Исследования на оспу овец (коз) проводят на двух клинически здоровых ягнятах (козлятах) в возрасте 2...3 мес., взятых от неболевших и невакцинированных против оспы маток.

Кожу вентрального бесшерстного участка хвоста подопытных животных обрабатывают 70°-ным этиловым спиртом, затем шприцом внутрикожно в два участка вводят по 0,2 мл надосадочной жидкости исследуемой суспензии (в разведениях 1:20 и 1:200).

Биопробу на оспу считают положительной при появлении у ягнят (козлят) на 6...8-й день после заражения характерных оспенных розеол, папул и пустул.

6.4. Биопробу на оспу свиней ставят на двух клинически здоровых поросятах в возрасте 2...3 мес. Кожу живота поросят в 4 участках размером 4,0x4,0 см выбривают, обрабатывают спиртом, затем скарифицируют, делая насечки длиной по 3 см. В скарифицированную поверхность кожи каждого участка втирают шпателем по 0,6 мл надосадочной жидкости исследуемой суспензии.

Результат исследования на оспу свиней считают положительным при образовании по ходу насечек через 6...8 дней после заражения характерной узелково-пустулезной сыпи и обнаружении в патматериале с этих мест методом микроскопии вирусных оспенных частиц.

6.4.1. Дифференциацию возбудителя, вызвавшего оспу у свиней, проводят на куриных эмбрионах (п. 5) или на поросятах. С этой целью используют 2 поросят, переболевших оспой (подопытные) и 2 здоровых (контрольные). Подопытным и контрольным поросятам втирают в два участка скарифицированной кожи по 2 капли растворенной сухой оспенной вакцины, изготовленной из вируса осповакцины.

Развитие оспин на скарифицированной коже подопытных и контрольных животных через 5...8 дней после нанесения вируса осповакцины указывает на наличие в хозяйстве оспы, вызванной вирусом оспы свиней.

Отсутствие оспенных поражений на коже подопытных животных (при положительной поствакцинальной реакции у контрольных поросят) свидетельствует о наличия у свиней оспы, вызванной вирусом оспы коров или осповакцины.

6.5. Биопробу на оспу верблюдов проводят на одном верблюжонке (отлученном от матки). Кожу бесшерстного вентрального участка хвоста или бесшерстного участка бедра животного обрабатывают спиртом, затем с помощью шприца внутрикожно в два участка вводят по 0,2 мл надосадочной жидкости исследуемой суспензии в разведении 1:20 и 1:200.

Результат исследования на оспу верблюдов считают положительным при образовании на 5...7-й день после заражения в местах инокуляции суспензии из патматериала папул и пустул, а также обнаружении в них методом вирусоскопии оспенных частиц.

6.5.1. Для дифференциации вируса оспы верблюдов от вируса оспы овец, коров и осповакцины переболевшему оспой и здоровому (контрольному) животным наносят глазной пипеткой на свежескарифицированную поверхность кожи 2...3 капли растворенной сухой оспенной вакцины, изготовленной из вируса осповакцины.

Развитие на месте скарификации кожи на 6...7-й день после нанесения вакцины пустул у подопытного и контрольного животных показывает на наличие в хозяйстве оспы, вызванной вирусом оспы верблюдов.

Отсутствие реакции у подопытного животного (при положительной поствакцинальной реакции у здорового контрольного животного) свидетельствует о наличии в хозяйстве оспы, вызванной вирусом оспы коров или осповакцины.

7. Диагноз на оспу животных считают установленным при получении положительного результата по одному из методов исследования, указанных в п. 1.2.

8. Срок исследования: вирусоскопического - 1 день; гистологического - 3...4 дня; выделения возбудителя - 6...12 дней; биопробы - 9 дней.

Настоящие Методические указания разработаны Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветеринарных препаратов (авторы старшие научные сотрудники Е.И. Скалинский, Ю.Ф. Борисович).

1.1. Окраска по Морозову. Для окрашивания по Морозову предварительно готовят три реактива:

- реактив N 1 (жидкость Руге): 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл 40%-ого формальдегида и 100 мл дистиллированной воды;

- реактив N 2: 5 г танина, 100 мл дистиллированной воды и 1 мл жидкой карболовой кислоты;

- реактив N 3: 5 г кристаллического азотнокислого серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды; из этого раствора в отдельный сосуд отливают 20 мл. К 80 мл оставшегося раствора по каплям добавляют 25%-ный раствор аммиака, пока образующийся желтовато-коричневый, а затем буро-черный осадок не растворяется и не останется лишь легкая опалесценция. Если добавление аммиака вовремя не прекращено, то берут раствор азотнокислого серебра (из 20 мл) и добавляют его по каплям до появления легкой опалесценции. Для окраски препаратов готовый реактив разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:10.

На приготовленные препараты (п. 2.2) наносят реактив N 1 (жидкость Руге), который через 1 мин сливают; промывают дистиллированной водой и протравливают реактивом N 2 при подогревания над пламенем спиртовки до появления паров (1...2 мин). Затем после промывания водой препараты покрывают одним слоем фильтровальной бумаги и обрабатывают реактивом N 3 при легком подогревании, пока мазки приобретут темно-коричневую окраску, после чего их вновь тщательно промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионной системой микроскопа.

1.2. Окраска по Пашену. Для окраски по методу Пашена предварительно готовят раствор для протравы по Леффлеру, состоящий из 20%-ого водяного раствора танина - 100 мл насыщенного водного раствора сернокислого закисного аммиачного железа - 50 мл и насыщенного спиртового раствора основного фуксина - 10 мл.

Перед окраской раствор фильтруют, наносят его на препараты, осторожно подогревают до появления паров и оставляют на несколько минут для остывания, затем смывают дистиллированной водой и наносят на препараты карболовый фуксин Циля; осторожно подогревают до появления паров, оставляют для остывания и снова промывают дистиллированной водой, высушивают на воздухе и просматривают под иммерсионной системой микроскопа.