1.1. Контагиозный метрит лошадей (КМЛ) - инфекционная болезнь лошадей и других однокопытных, характеризующаяся острым или хроническим воспалением эндометрия, слизистой оболочки шейки матки и влагалища, вызываемая бактерией Гемофилюс эквигениталис.

Для роста на искусственных питательных средах нуждается в специфическом ростовом факторе (X-фактор), который содержится в крови животных и в гемине (солянокислый гематин).

1.2. Предварительный лабораторный диагноз на контагиозный метрит лошадей устанавливают на основании результатов серологических исследований, окончательный - по результатам бактериологических исследований.

1.3. Материалом для бактериологического исследования от нежеребых кобыл служит слизь из шейки матки, взятая в период половой охоты, от жеребых кобыл - слизь из клиторной ямки; от жеребцов - слизь из уретрального канала.

1.4. Для серологического исследования направляют свежую или консервированную сыворотку крови лошади.

2.1. Перед взятием проб слизи у кобыл область промежности и вульву обмывают антисептическим раствором (водный раствор перманганата калия 1:1000) и тщательно осушают стерильными салфетками.

При взятии проб от нескольких кобыл нужно иметь как минимум два влагалищных зеркала с осветителями; перед использованием зеркала стерилизуют в кипящей воде, охлаждают и смазывают стерильным вазелиновым маслом.

2.2. При получении проб цервикальной слизи стерильную полистироловую осеменительную пипетку соединяют со шприцем при помощи резиновой трубки длиной 2 - 3 см и набирают 2 мл стерильного физиологического раствора. Пипетку вводят через зеркало в канал шейки матки на глубину 2 - 3 см, впрыскивают раствор и насасывают его обратно вместе с маточно-цервикальной слизью. Пипетка не должна касаться слизистой оболочки влагалища. Пробу сливают в пробирку с 3 мл стерильного физиологического раствора.

Для этой цели можно пользоваться приборами, употребляемыми при получении половой слизи от коров (Павловского, Жабоедова), или шприцем-катетером для искусственного осеменения коров.

2.3. От жеребых кобыл во избежание аборта слизь из шейки матки не берут. Пробы слизи из клиторной ямки отбирают с помощью небольшого стерильного марлевого тампона (без помощи зеркала). Тампон помещают в пробирку с 3 мл стерильного физиологического раствора.

2.4. От жеребцов пробы слизи берут небольшим стерильным марлевым тампоном из уретрального канала с помощью пинцета. Головку пениса предварительно обмывают теплой водой с мылом. Тампон помещают в пробирку с 3 мл стерильного физиологического раствора.

2.5. Пробирки с пробами слизи в термосе со льдом доставляют с нарочным в лабораторию не позднее чем через 3 - 4 ч с момента взятия.

2.6. Кровь у лошадей берут из яремной вены в объеме 2 - 3 мл. После отстаивания сыворотку сливают в пробирку и направляют в свежем, консервированном сухой борной кислотой (2% к объему) или 0,5%-ным раствором фенола виде.

3.1. Серологическая диагностика контагиозного метрита лошадей заключается в выявлении специфических антител в сыворотке крови больных животных в реакции агглютинации (РА).

3.2. Компоненты реакции.

3.2.1. Для РА необходимы следующие компоненты:

антиген КМЛ для РА (выпускает Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко, Москва, 109472, Кузьминки, ВИЭВ) представляет собой суспензию убитых микробных клеток возбудителя КМЛ в формалинизированном (0,25% формалина) физиологическом растворе, содержащую в 1 мл 10 млрд. микробных тел. Диагностикум хранят в холодильнике при 2 - 4 °C. Срок годности 12 мес. Антиген, подвергшийся замораживанию, для применения непригоден.

При хранении антигена на дне флакона образуется осадок белого цвета, который при встряхивании легко разбивается. При обнаружении плесени, посторонних примесей флакон бракуют;

испытуемые свежие или консервированные сыворотки крови лошадей. Гемолизированные или проросшие сыворотки для исследования непригодны;

позитивная неадсорбированная сыворотка КМЛ с заведомо известным титром в РА (прилагается к диагностикуму);

негативная сыворотка крови (здоровой лошади, прилагается к диагностикуму);

3%-ный раствор хлорида натрия (pH 7,2 - 7,4).

3.3. Постановка реакции.

3.3.1. Реакцию агглютинации ставят с двумя разведениями сыворотки - 1:20 и 1:40 в объеме 1 мл.

3.3.2. Для исследования каждой испытуемой сыворотки требуется три пробирки. В первой пробирке готовят основное разведение сыворотки (1:20). Для этого берут 0,2 мл испытуемой сыворотки и добавляют к ней 3,8 мл 3%-ного раствора хлорида натрия. Затем, пропуская вторую пробирку, в третью вносят градуированной пипеткой 1 мл 3%-ного раствора хлорида натрия. После этого из первой пробирки переносят во вторую и третью по 1 мл основного разведения сыворотки (1:20). Из третьей пробирки после смешивания 1 мл удаляют.

При массовом исследовании для разведения сыворотки крови и внесения компонентов реакции рекомендуется пользоваться аппаратом Флоринского.

3.3.3. Флакон с антигеном тщательно встряхивают до получения однородной взвеси, после чего его вскрывают и антиген в объеме 0,1 мл вносят во все пробирки второго и третьего рядов.

В пробирки первого ряда антиген не вносят, они служат контролем качества сыворотки. Наличие в испытуемой сыворотке хлопьев фибрина, эритроцитов и посторонних примесей указывает на ее непригодность к исследованию, и результаты реакции в таких случаях не учитывают.

3.3.4. После добавления антигена к испытуемым и контрольным сывороткам штатив с пробирками встряхивают и ставят в термостат при температуре 37 - 38 °C на 15 - 20 ч, затем выдерживают 3 - 4 ч при комнатной температуре, после чего проводят учет реакции.

3.3.5. при каждой постановке РА одновременно с испытуемыми сыворотками ставят контроли:

с позитивной сывороткой КМЛ в разведении до ее предельного титра;

с негативной сывороткой крови в тех же разведениях, что и испытуемые;

контроль на спонтанную агглютинацию (1 мл 3%-ного раствора хлорида натрия + 0,1 мл антигена).

3.4. Учет результатов.

3.4.1. Учет реакции агглютинации проводят макроскопически и оценивают в крестах по следующей схеме:

(++++) - полное просветление столбика жидкости и наличие рыхлого осадка на дне пробирки в виде зонтика. При осторожном встряхивании осадок легко разбивается на рыхлые волокнистые хлопья или комочки (100%-ная агглютинация);

(+++) - неполное просветление жидкости и хорошо выраженный зонтик (75%-ная агглютинация);

(++) - просветление жидкости и зонтик выражены умеренно (50%-ная агглютинация);

(+) - жидкость мутная, зонтик выражен очень слабо (25%-ная агглютинация);

(-) - жидкость равномерно мутная, на дне пробирки виден осадок антигена в виде точки.

3.4.2. Титром антител считают последнее разведение сыворотки, в котором отмечена агглютинация с оценкой не ниже чем на два креста.

3.4.3. Учет реакции проводят только при получении четких результатов в контролях:

положительный результат с позитивной сывороткой в разведении до ее предельного титра, указанного на этикетке;

отрицательный результат с негативной сывороткой крови в обоих разведениях;

отсутствие спонтанной агглютинации антигена в 3%-ном растворе хлорида натрия.

3.5. Диагностическая оценка РА.

3.5.1. Реакцию оценивают:

положительно - при наличии агглютинации не ниже чем на три креста в разведении сыворотки 1:40;

сомнительно - при наличии агглютинации не ниже чем на два креста в разведении сыворотки 1:20 или на один-два креста при разведении сыворотки 1:40;

отрицательно - при отсутствии агглютинации или агглютинации в разведении сыворотки 1:20 с оценкой в один крест.

3.5.2. При получении положительных или сомнительных результатов по серологии проводят бактериологическое исследование материала от этого же животного.

3.6. Срок серологического исследования - 4 дня.

4.1. Исследование патологического материала включает микроскопию мазков, приготовленных из присланного материала, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителя.

4.2.1. Пробы слизи тщательно встряхивают, тампоны отжимают и удаляют. На обезжиренное предметное стекло наносят каплю суспензии и распределяют ее по стеклу. Мазок высушивают на воздухе, фиксируют над пламенем и окрашивают по Граму.

В мазках из материала возбудитель имеет вид мелких грамотрицательных, иногда биполярно окрашенных коротких палочек.

4.3.1. Для выделения культуры возбудителя контагиозного метрита лошадей готовят специальную питательную среду - шоколадный агар, приготовленный на основе агара Мартена, перевара Хоттингера или МПА (см. приложение). Для подавления роста контаминирующей микрофлоры в среду добавляют 200 мкг/мл стрептомицина. Для выявления стрептомициноустойчивых штаммов параллельно проводят посев на среду без стрептомицина.

4.3.2. Посевы из исходного материала делают одновременно на две чашки шоколадного агара, две чашки шоколадного агара со стрептомицином и на обычные питательные среды (МПБ и МПА) для контроля.

Перед посевом чашки с шоколадным агаром делят на 3 - 4 сектора, 2 - 3 капли материала вносят в первый сектор и стерильным шпателем равномерно распределяют по его поверхности, затем этим же шпателем делают посевы во втором и в остальных секторах. По одной засеянной чашке каждой среды помещают в эксикатор или микроанаэростат, где создают атмосферу, содержащую 5 - 10% углекислого газа, и по одной культивируют в аэробных условиях.

Все посевы инкубируют при 37 - 38 °C в течение 10 сут, просматривая их каждые 2 - 3 дня.

4.3.3. На шоколадном агаре в атмосфере, содержащей 5 - 10% углекислого газа, Гемофилюс эквигениталис растет в виде единичных, мелких, выпуклых, округлой формы, блестящих колоний от бело-серого до светло-коричневого цвета. Колонии легко отделяются от среды и скользят по поверхности агара.

На МПА, МПБ и в аэробных условиях возбудитель контагиозного метрита лошадей не растет.

4.3.4. При обнаружении на агаре видимого роста изучают морфологические и культуральные свойства выделенных культур.

Возбудитель контагиозного метрита лошадей - неподвижная грамотрицательная коккобактерия, обладающая каталазной активностью и не образующая сероводород.

В мазках из культур возбудитель имеет вид полиморфных грамотрицательных палочек и нитей; при дефиците X-фактора он приобретает коккоподобную форму.

Для определения каталазной активности на поверхность бактериальной культуры, выращенной на плотной питательной среде, наливают 0,5 - 1,0 мл 3%-ного свежеприготовленного раствора перекиси водорода. Положительным результатом считают появление пузырьков газа в течение 5 - 10 мин.

Образование сероводорода определяют с помощью полоски фильтровальной бумаги, пропитанной раствором уксуснокислого свинца (20 г уксуснокислого свинца и 1 г бикарбоната натрия растворяют в 100 мл дистиллированной воды).

Культуру возбудителя засевают уколом в ПЖА с дефибринированной кровью (см. приложение). Индикаторную бумажку закладывают под пробку в засеянную пробирку так, чтобы нижний конец был на расстоянии 0,3 - 0,5 см от поверхности среды. Посевы инкубируют в условиях повышенного содержания углекислого газа при 37 - 38 °C в течение 5 - 10 дн. При образовании сероводорода полоска бумаги приобретает черно-бурый цвет.

Подвижность определяют общепринятым методом.

4.4. Срок бактериологического исследования - 20 дн.

5. Лабораторный диагноз на контагиозный метрит лошадей считают установленным при выделении культуры со свойствами, характерными для возбудителя этой болезни.

Шоколадный агар. К расплавленному и охлажденному до 80 - 90 °C агару Мартена, Хоттингера или МПА добавляют 5 - 10% стерильной дефибринированной крови лошади, барана или крупного рогатого скота. После тщательного перемешивания и охлаждения агара до 50 - 60 °C его разливают в чашки Петри. Среда пригодна для употребления при условии хранения в темноте при 4 - 8 °C в течение 10 дн.

Шоколадный агар со стрептомицином. В 100 мл стерильной дистиллированной воды растворяют 400 мг стрептомицина. В расплавленный и охлажденный до 50 - 60 °C шоколадный агар добавляют раствор стрептомицина (5 мл на 100 мл агара) и разливают в чашки Петри.

Полужидкий агар с дефибринированной кровью. К расплавленному и охлажденному до 45 - 50 °C ПЖА добавляют 5 - 10% дефибринированной крови, тщательно перемешивают и разливают по пробиркам.

Добавление различных компонентов в питательные среды проводят в стерильных условиях (боксах).