1.1. Лабораторная диагностика классической чумы свиней (КЧС) основана на:

- обнаружении антигена вируса КЧС реакцией прямой иммунофлуоресценции в клетках мазков-отпечатков проб органов;

- выделении эпизоотического вируса КЧС из патологического материала инокуляцией перевиваемой культуры клеток почки поросенка (РК-15) и его идентификации реакцией прямой иммунофлуоресценции;

- обнаружении специфических антител в сыворотках крови переболевших классической чумой свиней реакцией нейтрализации флуоресцирующих микробляшек или реакцией непрямой иммунофлуоресценции;

- выделении и идентификации вируса КЧС биопробой на животных.

Для постановки иммунофлуоресцентных реакций используют "Набор препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней".

1.2. При проведении лабораторной диагностики руководствуются "Правилами работы и охраны труда в ветеринарных лабораториях", утвержденными Министерством сельского хозяйства СССР 14 января 1975 г.

2.1. Отбор проб органов и подготовка патологического материала для исследования.

2.2. Приготовление мазков-отпечатков для постановки реакции прямой иммунофлуоресценции и экстрактов проб исследуемых органов для инокуляции культуры клеток (проводится одновременно).

2.3. Постановка реакции прямой иммунофлуоресценции (РПИФ) с целью обнаружения специфического антигена вируса КЧС в мазках-отпечатках из проб органов. По положительным или отрицательным результатам реакции ставят предварительный диагноз.

2.4. Инокуляция культуры клеток РК-15 экстрактами суспензий проб исследуемых органов с последующей постановкой РПИФ для обнаружения и идентификации эпизоотического вируса КЧС.

2.5. Исследование сывороток крови свиней в реакции нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (РНФМ) или реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ). Серологические исследования проводят в тех случаях, когда пробы крови получены от свиней, подозреваемых в переболевании классической чумой (ретроспективные исследования из хозяйств, не применяющих вакцинацию против КЧС в течение последних 2 лет.

2.6. Постановку биопробы проводят только по указанию Департамента ветеринарии, когда при подозрении на КЧС на основании эпизоотологического обследования получены отрицательные результаты лабораторных исследований.

3.1. Для исследования берут лимфатические узлы (подчелюстные и мезентериальные), части миндалин, селезенки, легкого, почки, кровь и костный мозг (из грудной или трубчатой кости) от 3...5 животных, убитых в стадии агонии, или не позже чем через 2...3 ч после гибели.

3.2. Пробы отбирают в стерильные флаконы массой 5...10 г каждый, герметически укупоривают резиновыми пробками.

Флаконы снаружи обрабатывают 5%-ным раствором едкого натра или осветленным 20%-ным раствором хлорной извести, обертывают марлей, смоченной тем же раствором, укладывают в полиэтиленовый пакет и помещают в термос со льдом. В случае длительной транспортировки (более 2 сут) пробы органов замораживают. Термос помещают в металлический контейнер, опечатывают и доставляют с нарочным в лабораторию с сопроводительным документом.

3.3. При ретроспективной диагностике направляют 5...10 проб крови (по 5...8 см³) от свиней, подозреваемых в переболевании классической чумой. Кровь берут не ранее чем через 15...20 сут после установления признаков болезни.

3.4. В лаборатории пробы селезенки, лимфатических узлов, легкого, почки каждого животного очищают от жировой и соединительной тканей и готовят по 2 мазка-отпечатка каждого органа для РПИФ. Для этого обезжиренные спирт-эфиром (1:1) покровные стекла укрепляют в расщепах деревянных палочек с условными номерами и делают мазок-отпечаток, прикладывая стекло к поверхности среза исследуемого органа (каждый отпечаток делается новым срезом органа). Мазки-отпечатки высушивают на воздухе при комнатной температуре (30...60 мин) и помещают в химический стакан с холодным (2...4 °C) ацетоном. Фиксацию проводят в камере бытового холодильника при (4 +/- 2) °C в течение 10...15 мин. Затем мазки-отпечатки извлекают из ацетона, высушивают и используют для постановки РПИФ. Хранят мазки-отпечатки при (4 +/- 2) °C не более 3 сут.

Контрольные отрицательные мазки-отпечатки готовят заранее, используя пробы органов от здоровых животных.

3.5. Навески каждого органа (примерно по 2 г) отдельно растирают в ступке со стерильным порошком из стекла или песком и готовят 20%-ную суспензию на стерильном 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Приготовленные суспензии дважды замораживают при -10...-12 °C, оттаивают при 30...37 °C и центрифугируют в рефрижераторной центрифуге при 2500...3000 об/мин в течение 10...15 мин. Надосадочную жидкость (экстракт) отсасывают, вносят 100 ЕД/см³ пенициллина и 100 мг/см³ стрептомицина (конечная концентрация), выдерживают 1 ч при (37 +/- 0,5) °C и готовят разведения 1:5 и 1:10 на стерильном 0,85%-ном растворе хлористого натрия. Для инокуляции культуры клеток используют как исходные (неразведенные) экстракты, так и разведенные.

3.6. Для получения сыворотки пробы крови выдерживают 1 ч в термостате при (37 +/- 0,5) °C или при комнатной температуре до образования сгустка. Сгусток обводят и пробы переносят в камеру бытового холодильника на 10...14 ч. Сыворотку отсасывают и используют для исследования.

4.1. Содержимое ампулы ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС растворяют 0,5 см³ дистиллированной воды и готовят рабочее разведение препарата на 0,01 М фосфатно-солевом буферном растворе - ФСБ (приготовление буферного раствора в Приложении, п. 1), указанное на ампуле.

4.2. Препараты мазков-отпечатков, приготовленные по п. 3.4, помещают на капли ФИТЦ-иммуноглобулинов КЧС, нанесенные в рабочем разведении на края предметных стекол, находящихся во влажной камере, и выдерживают при (37 +/- 0,5) °C в течение 30 мин.

4.3. Препараты снимают с предметных стекол, ополаскивают ФСБ и свободными концами спичек укрепляют в гнездах отмывочного штатива. Штатив помещают в цилиндрическую банку с раствором ФСБ, установленную на магнитную мешалку. Отмывание мазков-отпечатков от несвязавшихся или неспецифически связавшихся ФИТЦ-иммуноглобулинов ведут в течение 20 мин в темном месте, сменяя буферный раствор через 10 мин.

4.4. После отмывания препараты ополаскивают дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и помещают на капли нефлуоресцирующего глицерина, разведенного раствором ФСБ в соотношении 9:1, нанесенные на прозрачные обезжиренные предметные стекла. Края препаратов заливают расплавленным парафином.

4.5. Люминесцентную микроскопию препаратов проводят в сине-фиолетовом свете при освещении их сверху, через объектив на микроскопах типа "ЛЮМАМ". Возбуждающий светофильтр ФС-1-2 или СС-15-2; запирающий ЖС-18 + ЖЗС-19. Препараты последовательно просматривают при увеличении 7x10, 7x40 ("сухая" микроскопия), затем при необходимости в иммерсионной системе при увеличении 7x90, используя неразведенный нефлуоресцирующий глицерин.

4.6. Специфическую флуоресценцию учитывают в лимфоидных клетках паренхимы селезенки, лимфатических узлов, легкого, расположенных группами, а также в эпителиальных клетках миндалин и клетках эпителия почечных канальцев, расположенных группами. Флуоресценцию обнаруживают в виде яркого, зеленого, диффузного свечения цитоплазмы антигенсодержащих клеток.

4.7. Учет и оценка результатов.

Проводят по условной четырехкрестовой шкале при увеличении 5x40: (++++, +++, ++, +) обнаружение во всех полях зрения множества групп клеток с яркой зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат положительный; (+/-) обнаружение в 5...10 полях зрения единичных групп, состоящих из 3...5 клеток с зеленой цитоплазматической флуоресценцией - результат сомнительный; отсутствие в мазках-отпечатках клеток с цитоплазматической флуоресценцией. Свечение клеток тускло-зеленое - результат отрицательный.

Отдельно расположенные клетки с флуоресценцией цитоплазмы или ядра не учитывают.

5.1. Подготовленные для исследования экстракты 20%-ных суспензий проб органов (п. 3.5) вносят по 0,5...0,6 см³ в пробирки с культурой клеток РК-15, выращенной на стеклянных пластинках из покровных стекол (выращивание культуры клеток РК-15 в Приложении, п. 2), предварительно удалив ростовую среду. Для инокуляции суспензии каждого органа берут не менее 8 пробирок.

Пробирки помещают в термостат (37 +/- 0,5) °C на 2 ч. По истечении указанного времени инокулюм удаляют, монослой клеток однократно промывают средой Игла (МЕМ) без сыворотки. Затем в пробирки вносят по 2,0 см³ питательной среды, содержащей 2% фетальной сыворотки крупного рогатого скота (поддерживающая среда), и инкубируют 24...96 ч. Через 24 ч после инокуляции поддерживающую среду меняют на свежую. В качестве контроля культуры клеток (отрицательные препараты) 8 пробирок оставляют интактными, предварительно сменив ростовую среду на поддерживающую.

5.2. Каждые 24 ч по 2 пластинки с культурой клеток, инокулированной исследуемым экстрактом суспензии каждого органа, извлекают из пробирок, вставляют в расщепы спичек с номерами, обсушивают на воздухе до полного удаления влаги и фиксируют холодным ацетоном в течение 10 мин (п. 3.4).

5.3. С препаратами, приготовленными по п. 5.2, ставят РПИФ и проводят люминесцентную микроскопию (пп. 4.2...4.5).

5.4. Оценка результатов.

5.4.1. При обнаружении специфической желто-зеленой или зеленой диффузной флуоресценции в цитоплазме клеток, расположенных группами ("флуоресцирующие микробляшки"), и отсутствии ее в отрицательных препаратах вирус КЧС считают выделенным и идентифицированным, а результат положительным.

5.4.2. В случае обнаружений тусклой, диффузной зеленой флуоресценции в клетках препаратов и при отсутствии "флуоресцирующих микробляшек" после 96-часовой инкубации проводят 2 дополнительных пассажа.

Для этого пробирки с инокулированной культурой 1-го пассажа, взятые через 96 ч культивирования (п. 5.1), дважды замораживают при -10...-12 °C, оттаивают при 30...37 °C и культуральную жидкость используют в качестве инокулюма для проведения 2-го пассажа (пп. 5.1...5.4). 3-й пассаж проводят аналогично.

В случае отсутствия "флуоресцирующих микробляшек" в третьем пассаже результат считают отрицательным.

6.1. Постановка реакции нейтрализации флуоресцирующих микробляшек (РНФМ).

6.1.1. Исследуемые сыворотки и контрольные (специфическую и нормальную сыворотки, взятые из "Набора препаратов", перед постановкой реакции растворяют 0,5 см³ дистиллированной воды), прогревают при 56 °C 50 мин и разводят в пенициллиновых флаконах средой Игла (МЕМ) 1:8 (к 0,2 см³ сыворотки добавляют 1,4 см³ среды).

6.1.2. Во флаконы с разведенными сыворотками вносят равный объем 1000 ККИД₅₀/см³ вируса КЧС, шт. "Ши-Мынь", (титрование вируса и расчет рабочей дозы вируса в Приложении, п. 3), тщательно встряхивают и инкубируют в течение 60 мин в термостате при (37 +/- 5) °C.

6.1.3. После инкубации по 0,5 см³ смеси вносят в пробирки с выращенной культурой клеток РК-15 на стеклянных пластинках, предварительно удалив ростовую среду. На каждую сыворотку берут по 4 пробирки. В качестве контроля токсичности разведенные сыворотки без вируса в объеме 0,5 см³ вносят в 4 пробирки и 4 пробирки оставляют интактными, сменив ростовую среду на поддерживающую ("контроль культуры клеток").

6.1.4. Через 2 ч смесь из пробирок удаляют, монослой дважды промывают средой Игла (МЕМ) и заливают поддерживающую среду. Каждые 24 ч культуру клеток просматривают под малым увеличением светового микроскопа для контроля дегенерации клеток.

6.1.5. При отсутствии дегенеративных изменений клеток через 48 ч после внесения смесей пластинки извлекают из пробирок, готовят препараты (п. 5.2), ставят реакцию прямой иммунофлуоресценции (пп. 4.2...4.4) и проводят люминесцентную микроскопию (п. 4.5).

6.1.6. Оценка результатов.

Результаты начинают оценивать в том случае, если в препаратах, обработанных смесью "нормальная сыворотка - вирус", обнаруживают флуоресцирующие микробляшки при их отсутствии в препаратах, обработанных смесью "специфическая сыворотка - вирус".

При отсутствии флуоресцирующих микробляшек в препаратах, обработанных смесью "исследуемая сыворотка - вирус", результат считают положительным, в случае обнаружения - отрицательным.

6.2. Постановка реакции непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ).

6.2.1. Положительные и отрицательные тест-препараты (приготовление в Приложении, п. 4) помещают на капли исследуемых и контрольных (специфической и нормальной) сывороток, разведенных 1:20, нанесенные на края предметных стекол во влажной камере. На каждую сыворотку берут по 2 положительных и отрицательных тест-препарата. Обработку тест-препаратов сыворотками проводят при (37 +/- 0,5) °C в течение 30 мин.

6.2.2. Отмывание тест-препаратов от несвязавшихся антител проводят по п. 4.3.

6.2.3. Тест-препараты слегка подсушивают и помещают на капли раствора ФИТЦ-иммуноглобулинов антисвиных в рабочем разведении, нанесенные на края предметных стекол во влажной камере. Обработку тест-препаратов ФИТЦ-иммуноглобулинами антисвиными проводят при (37 +/- 0,5) °C в течение 30 мин.

6.2.4. Отмывание тест-препаратов от несвязавшихся ФИТЦ-иммуноглобулинов антисвиных, подготовку препаратов для люминесцентной микроскопии и микроскопию проводят по пп. 4.3 - 4.5.

6.2.5. Оценка результатов.

Проводят по интенсивности свечения антигенсодержащих клеток флуоресцирующих микробляшек положительных и отрицательных тест-препаратов, обработанных исследуемыми и контрольными сыворотками:

- яркое, желто-зеленое или изумрудное свечение вирусспецифических антигенов в зараженных клетках положительных тест-препаратов, обработанных исследуемыми и контрольными сыворотками;

- яркое, желто-зеленое или изумрудное свечение вирусспецифических антигенов в зараженных клетках положительных тест-препаратов, обработанных исследуемыми сыворотками, - результат положительный;

- тусклое зеленое свечение в клетках положительных тест-препаратов - результат отрицательный.

В положительных тест-препаратах, обработанных специфической сывороткой, наблюдают яркое желто-зеленое или изумрудное свечение вирусспецифических антигенов в зараженных клетках и отсутствие подобного свечения в специфических тест-препаратах, обработанных нормальной сывороткой; в отрицательных тест-препаратах, обработанных специфической и нормальной сыворотками, наблюдают тусклое зеленое свечение цитоплазмы клеток.

7.1. Для постановки биопробы используют 4 здоровых поросят 2...4-месячного возраста, полученных от свиноматок, не вакцинированных против КЧС и не содержащих в сыворотке крови специфических антител к вирусу КЧС, и 2 поросят такого же возраста, иммунных против КЧС. Для иммунизации поросятам вводят по 1000 ИмД₅₀/см³ вирусвакцины ЛК ВНИИВВиМ против классической чумы свиней и через 10...15 сут после прививки используют для постановки биопробы.

7.2. Животных помещают в разные боксы по два подсвинка в каждый станок.

7.3. Двух неиммунных подсвинков содержат в отдельном помещении в качестве контрольных.

7.4. Содержание и кормление животных должны соответствовать зоотехническим нормам.

7.5. Непосредственно перед введением готовят экстракты 20%-ных суспензий лимфатических узлов и селезенки подозреваемых в заболевании классической чумой свиней (п. 3.5) и фильтруют через фильтр "Миллипор" (или его аналог) с величиной пор 0,22...0,48 мкм.

Равные объемы экстрактов органов смешивают, при этом общий объем смеси должен быть не менее 20 см³.

7.6. Подготовленный материал вводят двум восприимчивым и двум иммунным животным внутримышечно, соблюдая правила асептики, с внутренней стороны бедра в количестве 3...5 см³ каждому поросенку. За животными ведут клиническое наблюдение с ежедневным измерением температуры тела в течение 15 сут.

7.7. Оценка результатов.

7.7.1. При повышении температуры тела у невакцинированных поросят до 40,5...42 °C, угнетении, отсутствии аппетита через 3...5 сут после введения исследуемого материала, на 5...10-е сутки после повышения температуры тела выше нормы проводят убой поросят и отбор проб органов (п. 3.1), их подготовку (п. 3.5) и исследование (пп. 5.1...5.4) с целью реизоляции и идентификации вируса КЧС. При выделении и идентификации вируса результат биопробы считают положительным.

7.7.2. При установлении заболевания и гибели невакцинированных и вакцинированных против КЧС поросят проводят дифференциальные лабораторные исследования на африканскую чуму свиней.

Диагноз на классическую чуму свиней считают установленным в случае:

- выделения и идентификации вируса КЧС в одной из исследуемых проб органов;

- выявления специфических антител в сыворотках крови свиней, полученных из хозяйств, не применяющих вакцинацию против КЧС в течение последних 2 лет;

- получения положительных результатов биопробы на животных, реизоляции и идентификации вируса.

9. Срок исследований: вирусологических - 2...12 сут, серологических - 1...2 сут, биопроба - 12...24 сут.

1.1. Предметные стекла по ГОСТ 9284-75, обезжиренные спирт-эфиром, взятыми в соотношении 1:1.

1.2. Влажная камера (чашка Петри) или стерилизатор с увлажненной фильтровальной бумагой.

1.3. Фосфатно-солевой буферный раствор (ФСК) 0,01 М pH 7,2...7,5 готовят, смешивая:

а) 0,01 М раствор двузамещенного фосфата натрия (1,42 г Na₂HPO₄ безводного или 1,78 г N₂HPO₄·2H₂O) с 0,85% хлористого натрия, воды дистиллированной до 1 дм³;

б) 0,001 М раствор однозамещенного фосфата калия (1,36 г KH₂PO₄) с 0,85% хлористого натрия, воды дистиллированной до 1 дм³.

Для приготовления 0,01 М ФСБ с pH 7,2...7,4 смешивают 850 см³ раствора "а" с 250 см³ раствора "б".

1.4. Штатив для отмывки препаратов изготавливают из пенопласта размером 10x10x2 см или из деревянной дощечки такого же размера.

1.5. Банка цилиндрическая по ГОСТ 23932-79.

1.6. Нефлуоресцирующий глицерин или глицерин для люминесцентной микроскопии (фирмы "Merck" art. 4095 или любой другой фирмы).

1.7. Парафин по ГОСТ 23683-79.

1.8. Магнитная мешалка любого типа.

1.9. Набор препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней.

2.1. Работу проводят в изолированном, стерильном помещении. При одновременной работе с другими линиями клеток принимают меры для предотвращения контаминации одной линии клетками другой.

2.2. Материалы, необходимые для поддержания и культивирования культуры клеток РК-15.

Среда Игла (МЕМ), содержащая L-глутамин (300 мг на 1 дм³).

Сыворотка фетальная крупного рогатого скота (КРС), не содержащая антител к вирусу диареи крупного рогатого скота.

- 0,25% раствор трипсина;

- 0,02% раствор версена;

- пенициллин, стрептомицин;

- пробирки биологические;

- флаконы (матрасы) РУ;

- покровные стекла 18x18;

- стерильные центрифужные флаконы 100...500 см³;

- рефрижераторная низкоскоростная центрифуга.

2.3. Культивирование клеток.

2.3.1. Суспензию клеток готовят на среде Игла (МЕМ), содержащей 5...10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, прогретой при (56 +/- 2) °C в течение 30 мин - ростовая среда. Ростовую среду считают пригодной для работы, если монослой формируется на 3...4-е сутки при посадочной концентрации клеток 100 000 в 1 см³ и объеме суспензии 100 см³/флакон РУ. Монослой клеток должен представлять собой единый пласт клеток с четким разделением границ между ними. При наличии округлых клеток с вакуолями, включениями и другими признаками цитопатологии данную партию культуры выбраковывают.

2.3.2. Пассаж (пересев) клеток проводят после образования сплошного монослоя клеток. Для этого из матраса удаляют ростовую среду и вносят подогретую до (37 +/- 0,5) °C смесь 0,25%-ного раствора трипсина и 0,02%-ного раствора версена в соотношении 1:9. Матрас помещают в термостат на 5...7 мин. Как только часть клеток начинает отслаиваться от стекла, 90...95% диспергирующего раствора удаляют, добавляют небольшое количество ростовой среды и матрацы энергично встряхивают до полного отделения клеток от стекла и берут пробу суспензии для подсчета клеток. Суспензию клеток разводят ростовой средой до концентрации 100 000 клеток/см³. К приготовленной суспензии клеток добавляют антибиотики из расчета 100 ЕД/см³ пенициллина и 100 мг/см³ стрептомицина и разливают во флаконы РУ по 100 см³ и по 2 см³ в пробирки с покровными стеклами. Инкубируют при (37 +/- 0,5) °C. В случае неудовлетворительного роста клеток и формирования монослоя ростовую среду меняют на свежую.

3. Титрование и определение инфекционной активности вируса КЧС. Вируссодержащую культуральную жидкость, разведенную от 10^-1 до 10^-6 раствором Эрла или Хенкса, вносят в объеме 0,5 см³ в пробирки с культурой клеток РК-15, выращенной на покровных стеклах, при этом ростовую среду предварительно удаляют. На каждое разведение вируссодержащего материала берут по 4 пробирки с хорошим монослоем.

После 2 ч контакта при (37 +/- 0,5) °C вируссодержащий материал удаляют и вносят по 2 см³ поддерживающей среды и инкубируют 3 сут при (37 +/- 0,5) °C. Затем пластинки из пробирок извлекают, высушивают, обрабатывают холодным ацетоном. После фиксации ацетон с препаратов удаляют обсушиванием на воздухе (1...2 мин) и ставят РНИФ.

Титром вируса КЧС считают наибольшее его разведение, при котором обнаруживают флуоресцирующие микробляшки или единичные клетки, содержащие специфический цитоплазматический антиген вируса. Вычисляют титр по методу Рида и Менча (или его модификации), выражая его в клеточно-культуральных 50%-ных инфекционных дозах (ККИД₅₀/объем).

4.1. Перевиваемую культуру клеток почки поросенка (РК-15), выращенную на покровных пластинках в пробирках, заражают стандартным вирусом КЧС (штамм "Ши-Мынь") в дозе 0,001...0,0001 ККИД₅₀/клетка в объеме 0,5 см³ на пробирку, предварительно удалив ростовую среду, и помещают в термостат при (37 +/- 0,5) °C на 2 ч. Затем, удалив вируссодержащую жидкость, вносят поддерживающую среду. Зараженную культуру клеток инкубируют в условиях термостата при (37 +/- 0,5) °C.

4.2. Через 48 ч инкубации пластинки с зараженной культурой клеток извлекают, укрепляют в расщепы спичек, высушивают, обрабатывают холодным ацетоном в течение 10 мин и хранят в герметически закрытом контейнере при температуре -10...-12 °C. Отрицательные тест-препараты готовят аналогично, исключая этап заражения культуры клеток.