1. Разработаны д.м.н. Ивановым Н.Г., к.б.н. Шеиной Н.И. (Российский государственный медицинский университет).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.

3. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium funiculosum F-149 - продуцента декстраназы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и ГОСТ Р 8.563-96 "Методики выполнения измерений".

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Систематическое положение микроорганизма

Округлые колонии имеют 4 - 5 мм в диаметре, в зависимости от плотности посева могут достигать 11 мм в диаметре. Поверхность колоний слабошероховатая, пушистая, консистенция мягкая. Воздушный мицелий имеет белоснежно-белую окраску. На 3 - 4 день развития желтовато-кремовый субстрат меняет свою окраску, становясь ярко-оранжевым. Продолжительность развития гриба составляет 26 - 30 дней. Репродуктивными органами гриба являются конидиеносцы с конидиями (споры), может также размножаться вегетативно (фрагментами мицелия).

Штамм Penicillium funiculosum F-149 получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГНИИгенетики. Штамм является продуцентом декстраназы. Активность по методу Нельсона составляет 10 - 12 ед./мл культуральной жидкости. Изучаемый штамм выделен из почвы, аэроб, растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 28 - 30 °С, оптимальный рН 6 - 8. Наиболее интенсивный рост наблюдается на агаризованном пивном сусле 7 °Б, для выращивания могут также использоваться картофельно-сахарозный агар, агаризованная среда Чапека, среда Чапека - Докса.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл./куб. м, пометка А.

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам и ярко-оранжевому окрашиванию субстрата на 3 - 4 сутки. Вопрос о корреляции между пигментной и ферментативной активностью плесневого гриба требует дополнительных исследований.

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают:

- правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;

- правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;

- требования, изложенные в руководстве "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980);

- положения "Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды - пивное агаризованное сусло 7 °Б. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3 - 4 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованное пивное сусло 7 °Б расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (канамицин, неомицин и др.) из расчета 20 - 30 мг на 1 л среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 28 - 30 °С. Через 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

где:

Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;

N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно, за 1 мин. - количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 кв. см. Составляя пропорцию, определяем, что за 1 мин. на стеклянную чашку Петри оседают клетки, содержащиеся в 1,57 л воздуха. Количество клеток в 1 куб. м воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин. х t (время аспирации, мин.).

Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Дата проведения анализа ______________________________

Место отбора пробы ___________________________________

Название лаборатории _________________________________

Юридический адрес организации ________________________

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования".

2. ГОСТ Р 8.563-96 "ГСИ. Методики выполнения измерений".

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (М., 1977, 7 с.).