Методические рекомендации подготовили:

сотрудники ВКНЦ АМН СССР, ИМР АМН СССР, НИИЭМ МЗ РСФСР, к.м.н. Г.М. Ротт, к.м.н. Т.В. Блинова, к.м.н. Г.М. Лапшина, И.В. Рожинская, к.м.н. И.И. Староверов, под редакцией проф. М.Я. Руда и проф. А.М. Поверенного.

Необходимость диагностики острого инфаркта миокарда (ОИМ) в ранние сроки заболевания не вызывают сомнений, так как своевременно поставленный диагноз позволяет вовремя начать адекватную терапию и предупредить развитие целого ряда тяжелых осложнений. Несмотря на значительные достижения в диагностике ОИМ, по-прежнему встречаются затруднения при распознании этого заболевания в первые часы болезни, когда общепринятые биохимические исследования и ряд других диагностических тестов еще не могут быть применены или оказываются малоинформативными. Эта проблема тесно связана и с решением вопроса об улучшении диагностики ОИМ на догоспитальном этапе, а также в условиях стационаров, не имеющих оборудования, необходимого для проведения сложных биохимических, ультразвуковых и ряда других исследований. В связи с этим продолжаются поиски новых и усовершенствование известных методов, позволяющих распознавать ОИМ в ранние сроки от начала заболевания.

Исследования последних лет показали высокий диагностический потенциал использования в этих целях миоглобинового теста. Закономерное увеличение содержания миоглобина (МГ) в крови больных ИМ и появление его в моче подтверждено с помощью высокочувствительных методов - радиоиммунологического анализа (РИА), иммуноферментного анализа (ИФА) и иммунохимического анализа.

Однако возможность широкого использования в практике отечественного здравоохранения (служба "скорой помощи", палаты интенсивной терапии, кардиологические отделения больниц, поликлиники и т.п.) диагностики ИМ с помощью определения МГ в биологических жидкостях появилась только с разработкой метода микроанализа МГ в реакции пассивной гемагглютинации и промышленного выпуска основанного на принципах этой реакции тест-набора "Диагностикум эритроцитарный для выявления миоглобина, иммуноглобулиновый сухой".

Миоглобин - гемсодержащий белок с молекулярной массой 17300 дальтон, отличающийся от гемоглобина фракцией глобина. Получен в чистом виде из скелетных мышц и миокарда многих видов животных и человека. В гладких мышцах не обнаружен. Миоглобин состоит из полипептидной части (глобин) и простетической группы (гем.). По данным рентгеноструктурного анализа он имеет сферическую глобулярную форму. Установлены состав белка (153 остатка аминокислот) и последовательность соединения аминокислот в молекулу.

Миоглобин является одним из ключевых соединений, определяющих высокую интенсивность окислительного метаболизма в скелетной мышце и, особенно, в миокарде. МГ обладает способностью обратимо связываться с кислородом. Основная его функция - транспорт кислорода от гемоглобина через межклеточное пространство к оксидазной системе мышечных клеток, а также поддержание оптимального кислородного градиента вблизи митохондрией. МГ выступает и как депо накопления кислорода в мышцах: депонирование происходит в период покоя, расход - в момент сокращения. Однако "емкость" этого источника кислорода невелика - при ишемии миокарда адекватное снабжение миоцита кислородом осуществляется лишь в течение 15 - 20 сек.

Миоглобин локализуется в различных участках миоцита. Благодаря мобильности МГ в миоците, отсутствию прочных связей с внутриклеточными структурами, а также небольшой молекулярной массе, он быстро выходит из мышечной клетки при ее повреждении и попадает в кровь, а затем выводится почками с мочой.

Уровень миоглобина в крови практически здоровых людей не превышает 95 нг/мл. В норме почками выводится не более 4 мкг/сутки МГ (в среднем 2 - 4 нг/мл), поэтому методами анализа с чувствительностью менее 1 нг/мл МГ в моче здоровых лиц не определяется.

Классификация состояний, сопровождающихся гипермиоглобинемией и миоглобинурией, приведена в таблице 1.

В последние годы в результате проведения ряда исследований накоплены данные о клинической значимости определения МГ в крови и моче. Однако использование этого теста в учреждениях практического здравоохранения тормозится отсутствием простых и надежных методов идентификации МГ.

Чувствительный и специфический метод РИА миоглобина в сыворотке крови, несмотря на свои положительные качества, обладает общими для всех радиоиммунологических методов недостатками: необходимостью использования дорогостоящего оборудования и требованием радиационной безопасности. Поэтому РИА может быть применим только в крупных центрах, оснащенных необходимой аппаратурой и квалифицированным персоналом. Такая трудность РИА, как требование радиационной безопасности, преодолена различными вариантами ИФА, которые отличаются высокой чувствительностью, специфичностью, стабильностью реагентов, возможностью автоматизации исследований. Однако, как РИА, метод ИФА достаточно трудоемок и может быть осуществлен лишь при наличии специального приборного обеспечения. Ни РИА, ни ИФА не позволяют идентифицировать МГ в образцах мочи.

Существенный выигрыш во времени анализа дает простой полуколичественный тест, основанный на принципе агглютинации латекса, однако чувствительность определения МГ с его помощью не превышает 100 нг/мл, в то время как РИА и ИФА имеют чувствительность выявления МГ 1 нг/мл.

В практике здравоохранения главными критериями ценности метода становятся (наряду с высокой чувствительностью и специфичностью) простота проведения анализа и учета его результатов, а также скорость получения требуемого результата. Этим требованиям в большей степени, нежели перечисленные методы, отвечает гемагглютинационный тест с помощью препарата "Диагностикум эритроцитарный для выявления миоглобина, иммуноглобулиновый сухой". Этот тест-набор выпускается отечественной промышленностью (Горьковским научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР) и может быть рекомендован для экспресс-анализа МГ в крови и в моче пациентов в качестве дополнительного теста диагностики ИМ в учреждениях здравоохранения, и в условиях "скорой медицинской помощи", т.к. он не требует специального оборудования.

"Диагностикум эритроцитарный для выявления миоглобина, иммуноглобулиновый сухой" представляет собой стабилизированные формальдегидом куриные эритроциты, покрытые антителами к человеческому МГ. В основу метода определения МГ данным тест-набором положена реакция пассивной гемагглютинации. МГ в исследуемом образце связывается с антителами на эритроцитах и вызывает их агглютинацию. В отсутствие МГ или при его минимальном содержании эритроциты выпадают под действием гравитационных сил на дно и формируются там в виде компактной точки.

Определение МГ тест-набором "Диагностикум эритроцитарный для выявления миоглобина, иммуноглобулиновый сухой" производится полуколичественным методом, однако, путем сравнения результатов, полученных данным методом и методом ИФА, показано, что они имеют равноценную информационную значимость.

"Диагностикум эритроцитарный для выявления миоглобина глобулиновый сухой" характеризуется следующими параметрами:

--------------------------------

<1> Высокая специфичность гемагглютинационного теста с помощью "Диагностикума эритроцитарного для выявления миоглобина, иммуноглобулинового сухого" позволяет существенно ускорить анализ путем отказа от получения сыворотки или плазмы крови. Для экспресс-анализа кровь берут у пациента из пальца в объеме 0,05 мл, как это делается при общем анализе крови, и переносят в дистиллированную воду. Практически мгновенно происходит лизис эритроцитов и других форменных элементов крови. Определение МГ в лизате крови осуществляют обычным для данного тест-набора приемом.

<2> В отличие от РИА и ИФА тест-набор "Диагностикум эритроцитарный для выявления миоглобина иммуноглобулиновый сухой" пригоден для определения МГ в моче. Образцы мочи пациентов не подлежат хранению, вследствие высокой скорости адсорбции МГ на стенках пробирок с пробами мочи. Поэтому, единственным требованием является необходимость анализа не позднее 5 мин. от получения пробы мочи у пациента. В отличие от мочи, подготовленные к анализу образцы сыворотки, плазмы или лизата крови могут храниться до начала анализа при 4 °C (условия бытового холодильника) несколько часов; в случае длительного хранения образцы следует заморозить при -20 °C.

При развитии некроза миокарда, например, при ИМ, разрушаются мембраны миоцитов и содержимое клетки, в том числе и белки, поступает в кровоток. Так как МГ имеет молекулярную массу (17800 дальтон) меньшую, чем ферменты, обычно используемые как маркеры некроза миокарда - КФК (80000 дальтон) или ЛДГ (130000 дальтон), он появляется в кровотоке раньше упомянутых ферментов. Этим определяется диагностическая значимость и ценность метода определения МГ при ИМ.

Контроль за уровнем МГ в крови позволяет диагностировать некроз миокарда раньше, чем другие известные сегодня биохимические методы, включая такие распространенные, как исследование активности КФК и ее МБ изофермента (рис. 1). Содержание МГ в крови оказывается повышенным уже через 1,5 часа после начала ангинозного приступа более, чем в 70% случаев, а к 6 часам - у 1001 больных крупноочаговым ИМ. Важная особенность динамики концентрации МГ в крови - быстрое ее увеличение (максимальный уровень отмечается к 7 - 10-му после начала ангинозного приступа с превышением верхнего предела нормы в 4 - 10 и более раз) и последующая быстрая нормализация (к 28 - 36 ч. заболевания при неосложненном течении ИМ). Это создает благоприятные предпосылки для диагностики повторного ИМ или распространения очага поражения (рис. 2).

Начиная со 2 по 50 час болезни содержание миоглобина в крови больного В. превышает верхнюю границу нормы.

Развитие ИМ передней стенки вызвало выраженную гипермиоглобинемию с максимальной степенью активности к 8 часу заболевания.

Распространение очага некроза на боковую стенку, отмечено после ангинозного приступа (стрелкой отмечен момент возникновения боли), сопровождалось повторным повышением содержания миоглобина в крови. Активность КФК в сыворотке крови приходит к норме к 106 часу заболевания (т.н. "пролонгированный тип") кривой активности КФК.

В последнее время показано, что между содержанием МГ в крови и кумулятивной активностью КФК и ее изофермента МБ КФК имеется четкое соответствие. На основании исследования содержания МГ в крови можно составить представление о размере некроза миокарда. Были найдены высокодостоверные соотношения между концентрацией МГ и прогнозом жизни больных и вероятностью развития "застойной" сердечной недостаточности. Так, например, если к 4-му часу заболевания уровень МГ в крови не превышает 500 нг/мл, то более 90% больных остаются живыми. Если же концентрация в крови МГ к этому часу превышает 500 нг/мл - прогноз плохой: летальность в этой группе составляет около 100%.

Малые размеры молекул МГ, в отличие от размеров молекул ферментов, используемых для диагностики ИМ, позволяют ему преодолевать почечный барьер. Поэтому, при ИМ миоглобинурия наблюдается так же закономерно, как гипермиоглобинемия. Динамика содержания МГ в крови и в моче, в основном, совпадает. Миоглобинурия отмечается уже в первые часы болезни (так к 8-му часу после ангинозного приступа МГ в моче обнаруживается у 80 - 90% больных крупноочаговым ИМ). Концентрация МГ в моче достигает максимальной величины к концу первых суток болезни и нормализуется через 3 суток от начала заболевания. Важное преимущество способа определения МГ в моче с целью диагностики ИМ - его методическая простота, которая позволяет получить ответ практически в любых условиях, в том числе и на догоспитальном этапе, в сельских амбулаториях и т.п.

Известно, что МГ миокарда иммунологически идентичен МГ скелетных мышц. Причины, которые могут вызвать гипермиоглобинемию и миоглобинурию, приведены в табл. 1. Подавляющее большинство из них трудностей для дифференциальной диагностики ИМ не представляют. Важно подчеркнуть, что в ситуациях, которые нередко имеют место у больных ИМ, и, следовательно, должны учитываться при оценке результатов миоглобинового теста, не было отмечено существенного изменения уровня МГ в крови. В частности, достоверного повышения уровня МГ не выявлено после однократной внутримышечной инъекции, пароксизмальных нарушений ритма сердца, на фоне выраженных признаков сердечной недостаточности без инфаркта миокарда, после дозированной физической нагрузки на велоэргометре, после приступа стенокардии, после инвазивных исследований (коронарной ангиографии и вентрикулографии).

Таким образом, диагностическая ценность определения МГ в крови и в моче состоит в том, что этот тест достаточно рано позволяет выявить ИМ. Кроме того, быстрая нормализация содержания МГ в крови позволяет, в некоторых случаях, уточнить диагностику распространения очага поражения или развития повторного ИМ. Определение концентрации МГ в крови позволяет составить суждение о величине очага поражения и отсюда уточнить прогноз заболевания. Несмотря на специфичность определения МГ, повышения его содержания в крови и в моче не являются показателем исключительного миокардального повреждения ИМ. Тем не менее, диагностическая значимость определения МГ в биологических жидкостях при ИМ оценивается высоко.

"Диагностикум эритроцитарный для выявления миоглобина, иммуноглобулиновый сухой" (в дальнейшем - диагностикум) производится Горьковским научно-исследовательским институтом эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР. Комплектуется 9 ампул с лиофильно высушенными эритроцитами, покрытыми антителами против миоглобина, а также 1 ампулой с лиофилизированным стандартом миоглобина.

Эритроциты перед работой ресуспендируют в 2,5 мл физиологического раствора (0,15 М хлорида натрия в дистиллированной воде), при этом концентрация взвеси эритроцитов составляет 0,8 - 1,2%. Миоглобин растворяют в 1 мл физиологического раствора, его концентрация в растворе равна 10000 нг/мл.

Хранение лиофилизированных и регидратированных компонентов диагностикума осуществляется в условиях бытового холодильника при температуре 6 +/- 2 °C. Активность эритроцитов резко снижается при замораживании.

Срок хранения компонентов диагностикума в лиофилизированном состоянии - не менее 1 года. Регидратированный миоглобин сохраняет активность в течение месяца, эритроциты - в течение 5 дней.

Изготовителем диагностикума гарантируется отсутствие влияния гемоглобина, альбумина и гамма-глобулинов на определение миоглобина с помощью данного диагностикума.

1. Эритроциты, покрытые антителами против миоглобина, должны представлять собой пористую массу коричневого цвета; миоглобин - пористую массу белого цвета.

2. Вскрывают ампулу с эритроцитами и ампулу с миоглобином, вносят в каждую 2,5 мл и 1,0 мл физиологического раствора, соответственно. Компоненты диагностикума при перемешивании вручную должны растворяться в физиологическом растворе за время не более 3 минут.

3. Регидратированные эритроциты должны представлять собой гомогенную супсензию коричневого цвета; миоглобин - прозрачный бесцветный раствор.

1. Вода дистиллированная.

2. Физиологический раствор (0,15 М хлорида натрия в дистиллированной воде).

1. Бытовой холодильник для хранения диагностикума.

2. Полистироловые микроплаты для иммунологических реакций с - V или U-образным профилем дна лунок; объем лунки не более 0,3 мл.

3. Пробирки стеклянные объемом 5 - 10 мл.

4. Приспособления для дозирования жидкости объемом 0,25 мл, 0,5 мл, 1,0 мл (стеклянная градуированная пипетка, автоматическая пипетка, шприц или иное дозирущее приспособление).

5. Дозатор жидкости объемом 0,025 мл (пастеровская пипетка, автоматическая пипетка, капельница или иное дозирущее приспособление).

6. Приспособление для двукратных разведений жидкости объемом 0,05 мл (диллютер из микротитратора Такаччи, автоматическая пипетка или иное приспособление).

Контроль специфической активности диагностикума производится при изготовлении препарата на производстве. На этикетках коробок с диагностикумом указывается чувствительность определения миоглобина.

В случае необходимости проводится контроль специфической активности диагностикума в реакции пассивной гемагглютинации.

ШАГ 1.

Дозатором объемом 0,025 мл внести 0,5 мл физиологического раствора в лунки 1 - 24 микроплаты.

ШАГ 2.

Дозанатором внести 0,05 мл раствора стандарта миоглобина из ампулы, входящей в комплект диагностикума (концентрация МИОГЛОБИНА - 10000 нг/мл). Приспособлением для двукратных разведений перемешать и перенести 0,05 мл в лунку 2, перемешать и перенести 0,05 мл в лунку 3 и т.д. Продолжить двукратные разведения до лунки 22. Две последние лунки ряда Б являются контрольными и в них раститровку раствора миоглобина не производят.

ШАГ 3.

Немедленно внести во все лунки дозатором по 0,025 мл суспензии эритроцитов, покрытых антителами против миоглобина (взвесь должна быть тщательно гемогенизирована вручную).

ШАГ 4.

Перемешать содержимое постукиванием пальцем по краям микроплаты для равномерного распределения эритроцитов по объему (осторожно! не допускать расплескивания!). Оставить пластину в комнате на листе белой бумаги на горизонтальной поверхности, предохраняя от вибрации и прямых солнечных лучей.

Учет результатов анализа проводят через 30 минут.

На схеме представлена картина характера осадка эритроцитов. В последней лунке, где эритроциты еще агглютинированы (13 лунка), разведение стандартного раствора миоглобина (титр) - 1:8192. Поэтому чувствительность определения миоглобина равна:

10000 (нг/мл) : 8192 = 1,2 (нг/мл).

Ряды А - Б: стандарт миоглобина; титр 1:8192 (13 лунка).

Под термином "чувствительность определения миоглобина" понимается то наименьшее количество белка, которое еще вызывает агглютинацию эритроцитов, покрытых антителами против миоглобина.

Диагностикум считается пригодным к использованию, если эритроциты агглютинированы в первых 11 - 14 лунках пластины с раститрованным стандартом миоглобина, а далее - выпадают в виде компактной точки. Это соответствует чувствительности определения миоглобина 0,5 - 5,0 нг/мл.

Представлен простейший вариант применения диагностического тест-набора, который рекомендуется для экспресс-диагностики ОИМ в первые часы от развития заболевания на догоспитальном этапе, приемном покое и т.п. Результатом анализа является информация о том, превышает ли содержание миоглобина в крови нормальный уровень.

ШАГ 1.

Приспособлением для дозирования жидкости внести в пробирку:

1. - при использовании диагностикума с чувствительностью определения МГ 0,5 или 1,0 нг/мл - 2,0 мл дистиллированной воды;

2. - при использовании диагностикума с чувствительностью определения МГ 2,0 нг/мл - 1,0 мл дистиллированной воды;

3. - при использовании диагностикума с чувствительностью определения МГ 4,0 нг/мл - 0,5 мл дистиллированной воды.

ШАГ 2.

В пробирку внести 0,05 мл цельной крови, взятой меланжиром из пальца пациента. Тщательно перемешать (происходит лизис эритроцитов и других форменных элементов; раствор лизата должен быть прозрачным, ярко-красного цвета).

ШАГ 3.

Дозатором перенести 0,05 мл раствора из пробирки в лунку микроплаты. Во вторую лунку внести 0,05 мл физиологического раствора.

ШАГ 4. см. раздел 4.4.1 ШАГ 3.

ШАГ 5. см. раздел 4.4.1. ШАГ 4.

Учет результатов анализа проводят через 20 - 30 минут.

Выпадение компактного осадка эритроцитов в виде точки на дно лунки N 2 свидетельствует об отсутствии самопроизвольной агглютинации эритроцитов и является контролем работоспособности диагностического тест-набора.

Выпадение компактного осадка эритроцитов в виде точки на дно лунки N 1 (вариант А) указывает на нормальное содержание МГ в крови пациента.

Агглютинация эритроцитов в лунке N 1 (вариант Б) указывает на повышенный уровень МГ в крови больного.

Данный вариант применения диагностического тест-набора дает информацию о диапазоне концентраций, в котором находится истинное значение концентрации миоглобина в биологической жидкости человека.

ШАГ 1.

I - 2,0 мл

II - 1,0 мл

III - 0,5 мл

Приспособлением для дозирования жидкостей внести:

I. - при использовании диагностикума с чувствительностью определения миоглобина 0,5 или 1,0 нг/мл - пробирку А - 2,0 мл дистиллированной воды, в пробирки Б, В и Г - по 2,0 мл физиологического раствора.

II. - при использовании диагностикума с чувствительностью определения миоглобина 2,0 нг/мл - в пробирку А внести 1,0 мл дистиллированной воды, а в пробирки Б, В и Г - по 1,0 мл физиологического раствора.

III. - при использовании диагностикума с чувствительностью определения миоглобина 4,0 нг/мл - в пробирку А внести 0,5 мл дистиллированной воды, а в пробирки Б, В и Г - по 0,5 мл физиологического раствора.

ШАГ 2.

Разведение 1:80

В пробирку А внести дозатором:

а) при анализе сыворотки или плазмы крови, мочи - 0,025 мл испытуемой жидкости;

б) при анализе цельной крови - 0,05 мл крови, взятой в меланжир из пальца пациента.

Тщательно перемешать (внесение цельной крови приводит к лизису эритроцитов и других форменных элементов крови; раствор лизата должен быть прозрачным ярко-красного цвета).

ШАГ 3.

I - 1,0 мл

II - 0,5 мл

III - 0,25 мл

Приспособлением для дозирования жидкости проводят разведения исследуемого образца. Для этого:

I. При использовании диагностикума с чувствительностью определения миоглобина 0,5 или 1,0 нг/мл - из пробирки А отбирают 1,0 мл и переносят в пробирку Б, перемешивают и переносят 1,0 мл в пробирку В перемешивают и удаляют из нее 1,0 мл. Пробирка Г - контрольная.

II. При использовании диагностикума с чувствительностью определения миоглобина 2,0 нг/мл - из пробирки А отбирает 0,5 мл и переносят в пробирку Б, перемешивают и переносят 0,5 мл в пробирку В, перемешивает и удаляют из нее 0,5 мл. Пробирка Г - контрольная.

III. При использовании диагностикума с чувствительностью определения миоглобина 4,0 нг/мл - из пробирки А отбирают 0,25 мл и переносят в пробирку Б, перемешивают и переносят 0,25 мл в пробирку В, перемешивают и удаляют из нее 0,25 мл. Пробирка Г - контрольная.

ШАГ 4.

Из каждой пробирки дозанатором переносят в соответствующую лунку микропласты по 0,05 мл жидкости.

ШАГ 5. см. раздел 4.4.1 ШАГ 3

ШАГ 6. см. раздел 4.4.1 ШАГ 4

ШАГ 7. Учет результатов анализа проводят через 30 мин. по характеру осадка эритроцитов. Оценку уровня миоглобина в испытуемом образце осуществляют по таблице 2.

Определения содержания миоглобина в биологических жидкостях человека в реакции пассивной гемагглютинации является полуколичественным методом. Рекомендуется и для научно-исследовательских целей.

ШАГ 1

Дозатором внести в лунки 1 - 12 микроплаты по 0,05 мл физиологического раствора.

ШАГ 2

В лунку 1 внести 0,05 мл испытуемого образца (сыворотка, плазма или лизат крови, моча). При анализе цельной крови предварительно проводят лизирование эритроцитов и других форменных элементов крови путем внесения 0,05 мл цельной крови в 0,25 мл дистилированной воды (разведение плазмы примерно в 10 раз).

Используя приспособление для двукратных разведений, перемешать и перенести 0,05 мл в лунку 2, перемешать и перенести 0,05 мл в лунку 3 и т.д. Продолжить двукратные разведения до лунки 11. Последняя лунка является контрольной и в ней раститровку миоглобина в испытуемых образцах не производят.

ШАГ 3 см. раздел 4.4.1. ШАГ 3.

ШАГ 4 см. раздел 4.4.1. ШАГ 4.

Учет результатов анализа проводят через 30 мин. На схеме

Ряд А: испытуемый образец; титр 1:512 (9 лунка).

представлена в качестве примера картина осадка эритроцитов и агглютинации в одном из исследуемых образцов. В последней лунке (9 лунка), где эритроциты еще агглютинированы, концентрация миоглобина равна чувствительности его определения. Поэтому содержание миоглобина в испытуемом образце определяют как произведение чувствительности его определения на титр:

В случае, если образец испытуемой плазмы, сыворотки крови или мочи до анализа разведен в n-количестве раз, то для определения содержания миоглобина в исходном образце биологической жидкости полученный результат следует умножить на число n.

Расчет содержания миоглобина в лизате цельной крови производят умножением полученного результата на число 10 (с учетом предварительного разведения образца цельной крови при лизисе).

После работы необходимо многократно промыть микроплату для иммунологических реакций, дозаторы и приспособления для разведений сначала проточной водой, а затем ополоснуть дистиллированной водой. Целесообразно для каждого вида работ иметь индивидуальный инструментарий. Не допускать высыхания ингредиентов реакции в лунках пластины. Необходимо помнить, что недостаточная отмывка микроплат для иммунологических реакций и инструментария может привести к ложным результатам.