1. Разработано: ООО "Стайлаб"; Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России.

2. Утверждены.

3. Вводится впервые.

Афлатоксины принадлежат к канцерогенным, высокотоксичным продуктам жизнедеятельности плесневых грибов рода Aspergillus flavus и Aspergillus parasiticus.

субстрат (зеленая крышка), содержащий пероксид карбамида, объемом 7 куб. см;

хромоген (голубая крышка), содержащий тетраметилбензидин, объемом 7 куб. см;

стоп-реагент (желтая крышка), содержащий 1 N раствор серной к-ты, объемом 14 куб. см.;

буфер 1 (белая крышка) для разбавления проб объемом 20 куб. см;

буфер 2 (белая крышка) для разбавления конъюгата объемом 12 куб. см;

состав для приготовления моющего буфера: 10 мМ фосфатный буфер (pH 7,4), содержащий 0,05% твина;

инструкцию по использованию тест-системы на русском и английском языках;

логарифмическую бумагу;

Центрифуга эффективностью 3500 g, с центрифужными пробирками;

колба коническая со шлифом и притертой пробкой на 100 куб. см типа КН-1 по ТУ 92-891.029-91;

пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками;

воронки лабораторные типа В-36 по ГОСТ 25336;

фильтровальная бумага "красная лента";

пипетки-пастерки;

лабораторный шейкер (только для сыра);

испаритель (только для сыра);

наконечники для автоматических пипеток;

ванночки для реагентов;

листовая фильтровальная бумага;

разовые резиновые перчатки;

тара для лабораторных отходов.

Замечания по использованию и хранению тест-систем RIDASCREEN FAST:

Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Срок годности тест-системы указан на этикетке.

Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Не используйте реагенты других производителей. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.

Храните набор при температуре 2 - 8 °C. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.

Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет.

Поскольку раствор хромогена светочувствителен, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флакон с раствором.

В случае голубоватого окрашивания розового раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора является признаком его порчи.

Если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0,6, это также может быть признаком порчи реагентов.

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.

4.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.

4.4. После каждого анализа следует тщательно промывать оборудование и лабораторную посуду для предотвращения перекрестного загрязнения от пробы к пробе. Все использованные материалы, жидкие отходы, расходные материалы и лабораторная посуда должны быть деконтаминированы путем замачивания в течение 30 минут в 5% растворе гипохлорита натрия с последующим добавлением в раствор ацетона 5% по объему и выдерживанием еще 30 минут. Для мытья стеклянной посуды, загрязненной афлатоксинами, рекомендуется использовать 10% раствор гипохлорита натрия. С помощью раствора соляной кислоты подкислите раствор гипохлорита до pH 7, залейте раствором загрязненную посуду и оставьте в контакте с раствором на ночь. Затем лабораторную посуду следует отмыть обычными лабораторными моющими средствами и промыть дистиллированной водой.

4.5. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Избегайте контакта стоп-реагента с кожей.

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе стажировки.

При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:

7.1. Отбор проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора. Пробы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодном темном месте.

7.2. Подготовка реактивов и материалов

Перед использованием доведите температуру всех реагентов (включая дистиллированную воду) до комнатной (20 - 25 °C). Это займет около 1 часа.

Микротитровальный планшет. Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов вместе с рамкой. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 - 8 °C.

Приготовление моющего буферного раствора. Набор содержит пакетик с солью. Для приготовления моющего буфера растворите содержимое пакетика в 1 л дистиллированной воды. Готовый буферный раствор может храниться при 4 °C в течение 4 недель.

7.3. Пробоподготовка

7.1. Молоко

7.1.1. Разлейте пробы молока в центрифужные пробирки и центрифугируйте в течение 10 мин. при 10 °C и ускорении 3500 g. При отсутствии в лаборатории центрифуги с охлаждением перед центрифугированием охладите пробы до 10 °C.

7.1.2. С помощью пипетки Пастера и резиновой лабораторной груши удалите верхний жирный слой.

7.1.3. Для анализа используют 100 мкл снятого молока.

7.2. Сухое молоко.

7.2.1. Взвесьте 10 г сухого молока и поместите навеску в колбу.

7.2.2. Добавьте в колбу 100 куб. см дистиллированной или деионизованной воды и перемешивайте раствор в течение 5 мин.

7.2.3. Далее следуйте пп. 7.1.1 - 7.1.3.

7.3. Сыр

7.3.1. Представительную пробу сыра следует тщательно растереть и перемешать без добавления жидкости. Участки сыра с плесенью следует отделить от пробы, чтобы исключить возможные мешающие влияния на результаты анализа.

7.3.2. Поместите 2 г сыра в центрифужную стеклянную пробирку.

7.3.3. Добавьте 40 куб. см дихлорметана.

7.3.4. Встряхивайте пробирку в течение 15 мин.

7.3.5. Отфильтруйте суспензию.

7.3.6. Испарите 10 куб. см экстракта в слабом токе азота при 60 °C.

7.3.7. Растворите жирный остаток в смеси 0,5 куб. см метанола, 0,5 куб. см фосфатного буфера, добавьте в пробирку 1 куб. см гептана, энергично встряхните.

7.3.8. Центрифугируйте в течение 15 мин. при 15 °C и ускорении 2700 g.

7.3.9. Удалите верхний гептановый слой.

7.3.10. С помощью пипетки Пастера осторожно отберите нижний водно-метанольный слой.

7.3.11. К аликвоте 100 мкл добавьте 400 мкл буфера N 1 (разбавление 1:5 до концентрации метанола 10%).

7.3.12. Для анализа используют 100 мкл раствора.

8.1. Предварительные замечания к проведению измерений с помощью тест-системы RIDASCREEN FAST:

- немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 - 8 °C, избегайте длительного хранения реагентов при комнатной температуре;

- иммуноферментная реакция начинается после добавления в лунки планшета препарата антител. При дозировании рекомендуется использовать многоканальную пипетку;

- в процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета. Избегайте перерывов при выполнении анализа;

- воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета;

- на всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света. Во время инкубации рекомендуется ставить планшет в темное место или прикрывать планшет непрозрачным экраном.

8.2. Проведение измерений

8.2.1. Извлеките из фольгированного пакета необходимое количество лунок - по две лунки на каждую пробу. Поместите лунки в рамку.

8.2.2. Немедленно упакуйте оставшиеся лунки в фольгированный пакет вместе с осушителем и поместите на хранение при 4 °C.

8.2.3. Нанесите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов, на разграфленную бумагу, как это показано на рисунке (Ст. - стандарты, Пр. - пробы):

8.2.4. Пометьте лунки, чтобы идентифицировать их после промывки.

8.2.5. Осторожно, не допуская вспенивания, перемешайте флаконы с реагентами.

8.2.6. Перед пипетированием смачивайте каждый свежий наконечник пипетки дозируемым раствором (наберите и выпустите раствор).

8.2.7. Добавьте по 100 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие пары лунок. При каждом дозировании используйте новый наконечник дозатора.

8.2.8. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре (20 - 25 °C) в течение 60 мин. в темноте.

8.2.9. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующей добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета, осторожно и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.

8.2.10. С помощью дозатора наполните лунки по 250 мкл моющего буферного раствора и снова вылейте жидкость. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.

8.2.11. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте по 100 мкл готового раствора конъюгата в каждую лунку.

8.2.12. Тщательно перемешайте, осторожно вращая планшет рукой, и оставьте на инкубацию при комнатной температуре (20 - 25 °C) в течение 60 мин. в темноте.

8.2.13. Вылейте жидкость из лунок. Во избежание появления пленки поверхностного натяжения, препятствующий добавлению промывочного раствора в лунки, переверните рамку планшета, осторожно и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного (не более!) постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой.

8.2.14. С помощью дозатора наполните лунки по 250 мкл моющего буферного раствора и снова вылейте жидкость. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.

8.2.15. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте по 50 мкл субстрата в каждую лунку.

8.2.16. Осторожно, не касаясь лунок, добавьте по 50 мкл хромогена в каждую лунку.

8.2.17. Перемешайте вручную, соблюдая осторожность, и инкубируйте при комнатной температуре (20 - 25 °C) в течение 30 минут в темноте.

8.2.18. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента (желтая крышка) и хорошо перемешайте.

8.2.19. В течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм относительно воздуха.

Значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами, делятся на значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:

Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например РИДА(R) Софт. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения и рекомендациями разработчика.