Составители - сотрудники НИИ детских учреждений; к.б.м. ст. науч. сотр. Мурина Е.А., д.м.м., профессор Аксенов О.А.

Методические рекомендации посвящены основам и приемам диагностики энтеровирусных инфекций у детей. Обсуждаются методики ускоренной лабораторной диагностики при серозных менингитах, сообщается о новых диагностических разработках, позволявших проводить экспресс-диагностику энтеровирусных серозных менингитов.

Набор диагностических тестов основан на выявлении энтеровирусных антигенов и их типировании в новом оригинальном иммуноферментном методе, включающем в себя реакцию связывания компонента с последующим его тестированием иммунно-ферментным способом.

Значительная часть инфекционных поражений нервной системы у детей этиологически связана с энтеровирусной инфекцией. В настоящее время энтеровирусные серозные менингиты являются одной из наиболее распространенных форм этих заболеваний. Лабораторная диагностика энтеровирусов представляет значительные трудности. Они связаны с многообразием типов и подтипов возбудителей данной группы, что осложняет их обнаружение.

Выделение и типирование энтеровирусов, а, следовательно, этиологическая расшифровка энтеровирусных серозных менингитов, включает в себя большой комплекс исследований и занимает длительный период времени. Основные этапы этиологической диагностики состоят в выделении цитопатогенного агента (ЦПА) в культуре ткани или выявлении возбудителя на новорожденных мышах, накопление его и, наконец, типирование. При типировании устанавливается серотип возбудителя в реакциях нейтрализации со стандартными диагностическими сыворотками. Заключительным этапом исследования является выявление нарастания антител к выделенному аутоштамму в крови больного. Все эти процедуры в практических лабораторных условиях занимают не менее 3-4-х месяцев от появления энтеровирусных заболеваний в коллективе и начала вспышки в регионе.

На современном этапе лабораторной диагностики различных вирусных инфекций для многих из них разработаны ускоренные методы выявления антигенов или противовирусных антител к ним с использованием современных тестов на основе твердоматочных систем (РНГА с антительным и антигенным эритродитарными диагностикумами, латекс-тесты, твердофазные иммуноферментные, радиоиммунные и другие системы). Однако для диагностики энтеровирусных инфекций они практически не применимы из-за большого числа сероподтипов вирусов данной группы, и невозможности, вследствие этого, точного типирования энтеровирусного штамма. В настоящее время для этой цели используют РИГА и латексный диагностикам с целью обнаружения антигенов и антител суммарно для энтеровирусов группы Коксаки В, включающей в себя только 6 вирусов. Количество же вирусов Экхо превышает пятьдесят серотипов (и их вариантов), поэтому создание такого рода диагностикумов для этой группы практически нереально.

В то же время, в связи с появлением в лечебной практике ряда способов этиологического лечения вирусных инфекций, а также с целью дифференциальной диагностики, возникает крайняя необходимость быстрой постановки вирусологического диагноза. С другой стороны, при расшифровке вспышек энтеровирусных инфекций, хотя экспресс диагностика и не так важна, длительное вирусологическое обследование может исказить точность пейзажа вспышки из-за появления технических ошибок. В связи с этим, до настоящего времени, остается чрезвычайно актуальной проблема разработки ускоренного метода вирусологической расшифровки заболеваний энтеровирусной этиологии.

В настоящих методических рекомендациях обобщается опыт 12-летней работы лаборатории вирусологии СПб НИИ детских инфекций МЗ РФ по диагностике энтеровирусных инфекций (главным образом серозных менингитов).

При классической вирусологической диагностике энтеровирусных заболеваний, и, в частности, серозных менингитов у детей, необходимо учитывать три направления этиологической расшифровки.

А. Этиологическая расшифровка эпидемических вспышек серозных менингитов в определенной географической зоне, в частности в большом городе. В данном случае в лабораторию одновременно поступает большое количество клинически однородных материалов для исследования.

Б. Этиологическая расшифровка небольших локальных вспышек инфекции в одном коллективе или семье.

В. Вирусологическое обследование материалов от больных детей, поступивших в клинику, для дифференциальной диагностики нейроинфекций различной этиологии.

В тактическом плане эти три направления имеют свои особенности при выделении и типировании энтеровирусов для постановки окончательного диагноза. В настоящих методических рекомендациях в дальнейшем не описываются основные классические принципы выделения и типирования энтеровирусов у больных, так как они достаточно полно представлены в методических рекомендациях Н.В.Галко и руководстве М.К.Ворошилова "Энтеровирусные инфекции человека" М., 1979 г.

В этом разделе мы приводим только методические особенности диагностики энтеровирусной инфекции по указанным выше трем направлениям.

При достаточно выраженной эпидемической ситуации в городе или регионе в лабораторию одномоментно поступают материалы от значительного числа больных. В среднем (по данным НИИДИ г. СПб) в первую неделю эпидемического подъема их количество достигает 200. Из этой массы, для быстрой характеристики вспышки, достаточно взять в работу материалы от 40-60 больных. Фекальные массы больных детей, обработанные по классическим методикам с добавлением антибиотиков вносятся в тканевые культуры линий Hep-2 или Hella (для выделения вирусов группы Коксаки и полиомиелита) и диплоидную культуру фибробластов легкого эмбриона человека (для выделения вирусов группы Экхо). Выборка материалов, подвергающихся исследованию, включает в себя пациентов, поступивших в клинику главным образом на первых днях заболевания.

Выделение ЦПА проводят в течение первой недели обследования, а повторные субпассажи осуществляют только при наличии культуры ткани и свободных рабочих рук в лаборатории. Цитопатогенные агенты, выявленные в первые два дня после внесения материала в культуру ткани, могут быть дополнительно перепассированы для исключения токсического эффекта. К 4-5 дню, после начала обследования, удается обнаружить 20-25 материалов с ЦПА, которые подвергаются первичному типированию классическими методами.

Особенностью работы данного этапа являются следующие моменты:

1) не проводится накопление и титрование вируса.

Материалы с ЦПА сразу используются в опыте по типированию с поливалентными сыворотками; материал с ЦПА берется в реакцию в разведении 1:10.

2) Для проведения типирования целесообразно оставлять часть тканевой культуры, используемой при первичном заражении. Этот момент ускоряет этап первичного типирования на 5-7 дней и обеспечивает однотипность полученных результатов.

3) Окончательное типирование вирусов с моновалентными диагностическими сыворотками необходимо проводить с тем же пулом исследуемого материала, который включался в первый этап работы, для ускорения и достоверности полученных результатов.

Данный цикл исследований (при достаточном обеспечении) осуществляется за 10-12 дней. К этому сроку, а особенно если удается провести аналогичные исследования со второй группой больных, можно составить картину эпидемического подъема заболеваемости в городе. При достаточно выраженной заболеваемости такая тактика позволяет при обследовании 30-40% поступивших материалов получить достоверные результаты по этому эпидемическому подъему.

По результатам 12-летней работы НИИДИ, мы можем сделать заключение, что обследование части больных достоверно выявляет нам доминирующий тип, а также часто встречавшиеся и единичные серотипы. Для окончательного установления доминирующего типа обязательна постановка парных сывороток больных с аутоштаммом. В этом случае 4-х кратная сероконверсия или высокие титры антител проявляются практически у 80-90% больных. Оставшиеся материалы включаются в обследование по классической схеме выделения энтеровирусов, однако, после получения результатов, они практически не изменяют картину вспышки.

При обследовании локальных вспышек в коллективе или семье, в отличие от первого направления, проведение пассирования исследуемого материала является неотъемлемой частью этапа работы. Делается 3-х кратное пассирование фекальных масс на двух линиях указанных выше тканевых культур с инкубированием не менее пяти суток. Связано это с тем, что обследование одиночных вспышек проводится вне эпидемического подъема заболевания и поэтому вирус оказывается менее патогенным для тканевой культуры и накапливается в первом пассаже в титрах, не дающих ЦПЭ. После обнаружения ЦПА проводится постановка классическими методиками опыта типирования, завершающего данное исследование.

Особенностью данного направления являются следующие моменты:

1) одновременно с обследованием больных проводится обследование всех лиц находившихся в контакте в данной группе или семье. Равно, как материалы от больных, так и материалы от контактных проходят 3-х кратное пассирование на двух линиях тканевых культур. При таком обследовании в 10-15% случаев у контактных лиц возможно обнаружение штаммов идентичных штаммам, выделяемым от больных. Эти лица подлежат обязательному клиническому и лабораторному наблюдению. При выделении вируса в обследуемом коллективе или в семье от больных и, особенно от контактных лиц все подвергаются повторному обследованию через 10-14 дней, где особое внимание уделяется лицам с первичным отрицательным результатом.

2) При обследовании локальных вспышек достаточно часто наблюдается положение, при котором от больных выделяются одни серотипы вирусов, а от контактных с ними лиц другие. Так по нашим данным при серозных менингитах у детей, заболевших в коллективе, более достоверно обнаружение вирусов группы Экхо (4; 6; 11; 30 серотип), а у контактных лиц группы Коксаки (4; 5; 6 серотип). В связи с этим исследование парных сывороток на наличие антител для дифференцировки вируса, вызвавшего заболевание у данной группы детей, обязательно. Проводить такую дифференцировку необходимо в одно время и в одном опыте.

Для обследования детей при дифференциальной диагностике нейроинфекций различной этиологии в отличие от первых двух направлений применяется следующая тактика:

1) Для обследования этих больных в лабораторию должны поступить, кроме трех проб фекаций, первая, а затем вторая сыворотка крови и обязательно ликвор, взятый в острый период заболевания (не более 0,5-0,7 мл).

2) Обследование необходимо начинать с координированного взаимоотношения между клиницистом и вирусологом, для установления возможного эпидемического диагноза на основе клинических и эпидемиологических данных. В эпидемиологическом плане особое внимание уделяется заболеваниям серозными менингитами в семье или коллективе, времени года, посещению леса, укусам клещей, а также наличию капельных инфекций и анамнестическим данным о кожных проявлениях возможно герпетической природы.

3) Дифференциальный диагноз проводится между следующими клиническими формами нейроинфекции: герпетический менингоэнцефалит, менингоэнцефалиты, являющиеся осложнением коревой, краснушной и ветряночной инфекции, а также клещевой энцефалит и болезнь Лайма. Обследуемые материалы фекалий и ликвор ставятся классическими методами по определению энтеровирусов. Одномоментно, уже в первой сыворотке крови больного ребенка, определяют наличие антител к вирусу краснухи (в РТГА), кори (в РНГА), а так же клещевого энцефалита (в РСК) и болезни Лайма (в реакции непрямой иммуннофлуоресценции и РСК). При наличии антител в какой-нибудь из указанных реакций, в титре 1:20 и более, а так же отсутствий ЦПА при первичном заражении тканевых культур, дальнейшее обследование проводят только на ту инфекцию, к которой выявлены антитела. При обнаружении ЦПА в культуре ткани при первом пассаже все внимание вирусолога должно быть уделено типированию этого агента всеми классическими методами, включающими в себя не только типирование энтеровируса, но и вируса герпеса I и II серотипа в реакциях нейтрализации в культуре ткани. Если ЦПА выделен из ликвора, то по нашим данным, он скорее относится к группе герпеса или клещевого энцефалита, т.к. даже в случаях массового выделения штаммов энтеровирусов 95-97% падает на обнаружение его в фекалиях и лишь 3-5% в ликворе. При наличии ЦПА в фекалиях мы может достоверно говорить об энтеровирусной инфекции, хотя в 1-2% случаях возможно спонтанное выделение аденовирусов (перевиваемые тканевые культуры) или ротовирусов (тканевая культура первичных фибробластов человека). Их типирование проводится по специальным методикам. Типирование ЦПА, обнаруженного в фекалиях, проводят классическими тестами, но до этапа установления серогруппы. Это возможно и допустимо, т.к. окончательное установление серотипа в клиническом отношении не столь существенно, как уменьшение времени до констатации вирусологического диагноза энтеровирусной инфекции. Все методические особенности, описанные нами в первом направлении, способствующие ускорению диагностики, должны быть применены и в данном случае.

Описанные нами в первом разделе модификации классических схем выявления энтеровирусов не только ускоряют время получения ответа, но и облегчают работу вирусолога. Однако ими невозможно проводить экспрессную диагностику с целью этиологического лечения. Основная сложность использования известных в настоящее время высокочувствительный методов для диагностики группы энтеровирусов, заключается в большом количестве серотипов и, следовательно, невозможности разработки соответствующих антительных диагностикумов. Так, например, для приготовления твердофазного иммуноферментного диагностикума, используемого для типирования энтеровируса, выделенного от одного больного, в микротесте необходима целая 96-луночная панель.

В настоящее время при любых разработанных диагностикумах и системах реакции для определения возбудителя в этой группе вирусов остается в силе основной принцип, основанный на первичном типировании вирусов с группоспецифическими диагностическими сыворотками и последующее типирование возбудителя с моносыворотками внутри обнаруженной группы.

В лаборатории вирусологии СПб НИИДИ в последние годы разработан тест экспрессного (в течение суток) выявления антигенов энтеровирусов и их типирования. Для исследования используют экстракт фекалий больного или его спинно-мозговую жидкость.

Тест базируется на оригинальной модификации жидкостного иммуноферментного анализа. Отличие данного теста от твердофазных методов заключается в том, что за основу его принята не стандартная реакция связи вируса с антителом, закрепленным на твердой матрице, а высокочувствительная разновидность реакции сорбции комплемента на иммунный комплекс, образующийся в жидкой фазе реакции между антителами диагностической сыворотки к энтеровирусу и соответствующим антигеном, присутствующим в экстракте фекалий или ликворе больного. Остаток не сорбированного на комплекс комплемента учитывается спектрофотометрически в количественном ферментном тесте.

Реакция ставится в мединалово-вероналовом буфере (МВБ). Исследуемый материал (недосадочная жидкость фекалии или ликвор) в объеме 0,05 мл вносится в специальные пробирки от аппарата "Эбботт" (производство США). Количество пробирок соответствует числу группоспецифических диагностических сывороток, используемых на первом этапе исследования. Сыворотки в основном опыте добавляются к исследуемому материалу в объеме 0,05 мл. При исследовании для каждого материала дополнительно ставятся следующие контроли:

- одна пробирка с мединалово-вероналовым буфером, внесенном в объеме 0,4 мл;

- одна пробирка для контроля комплемента, куда вносится 0,1 мл МБВ и 0,1 мл комплемента;

- одна пробирка для контроля системы выявления свободного комплемента, куда вносится 0,2 мл МБВ и 0,2 м системы;

- одна пробирка для контроля исследуемого материала, куда он вносится в объеме 0,05 мл с последующим добавлением 0,05 мл МБВ;

- по одной пробирке для контроля группоспецифических диагностических сывороток, куда вносится по 0,05 мл МБВ и 0,05 мл данных сывороток.

Все пробирки при обследовании материала от одного больного помещают на "Эбботт-панель" и инкубируют в термостате при 37 град. C в течение 60 минут.

По истечении этого времени во все пробирки, исключая пробирки для контроля мединалово-вероналового буфера и контроля системы выявления свободного комплемента, добавляют четко оттитрованную одну дозу комплемента в объеме 0,1 мл. Все планшеты помещаются в термостат на 60 минут.

В это время приготавливается "ex tempore" система для выявления свободного комплемента, которая по окончании времени второго контакта, добавляется по 0,2 мл во все пробирки за исключением пробирки контроля мединалово-вероналового буфера. После проведения этого этапа работы все "Эбботт-панели" с пробирками помешают в прозрачную суховоздушную баню марки УВМИ - 12-50 при t +35 град. C с остановленным шутельным механизмом. Через прозрачную крышку ведется постоянное наблюдение за кодом реакции и при появлении первых признаков гемолиза в контрольных пробирках с комплементом они извлекаются и сразу же во все пробирки добавляют смесь для выявления каталазной активности в объеме 0,5 мл. Через 5-6 минут реакция останавливается с добавлением 1,0 мл H2SO4.

Учет реакции производится сразу после добавления кислоты т.к. продолжение гемолиза в контрольных и опытных пробирках может изменить цветность реакции и, следовательно, достоверность получаемых результатов. Учитывается реакция на американском аппарате "Эбботт" при установленном фильтре 492-600 по программе "Mode-O-Ran". Измерения производятся от контроля мединалово-вероналового буфера.

Полученные результаты расшифровываются в сопоставлении всех контролей с исследуемым материалом. Наименьшее цифровое значение, выявляемое в одной из опытных пробирок смеси исследуемого материала с группоспецифической сывороткой, констатирует присутствие у больного антигена энтеровирусов соответствующей группы.

На втором этапе проводится внутригрупповое типирование обнаруженного антигена. Реакция проводится аналогично первому этапу, но вместо групповых диагностических сывороток используются моноспецифические. Объемы вносимых ингредиентов, проставляемые контроли и учет полученных результатов, полностью соответствуют выше описанному.

Таким образом, с помощью представленного экспресс-теста возможно в течение 4-6 часов (один рабочий день) выявить в исследуемом материале от больного антигены энтеровирусов, оттипировать соответствующий вирус, принципиально оценить его количество и дать заключение о наличии энтеровирусной инфекции.

Проведенные в вирусологической лаборатории НИИДИ г. СПб исследования подтверждают эффективность данного метода, особенно при определении пейзажа эпидемии и обследовании отдельных вспышек. При дифференциальной диагностике энтеровирусной инфекции у отдельных больных, экспресс-метод должен быть дополнен этапом выявления сероконверсий в парных сыворотках. При выявлении вирусного антигена у больного и необходимости срочного определения антител к нему, мы предлагаем вариант экспрессного определения антител с использованием антигена, обнаруженного у больного. Обследование проводится по описанной выше схеме, где в основной опыт вносится прогретая сыворотка больного в разведении 1:10 и указанный антиген.

Снижение показателей экстинкции на 25% от уровня контроля исследуемой сыворотки соответствует титру антител 1:10 - 1:20, на 40% - 50% - 1:40 - 1:80, а выше 50%, титру 1:160.

Этим же методом можно проставлять и парные сыворотки, рассчитывая сероконверсию, как по указанным титрам, так и непосредственно по уменьшению спектрофотометрических показателей.

Достоверность представленного экспресс-теста обоснована в вирусологической лаборатории НИИДИ г. СПб двухгодичным параллельным изучением этиологии серозных менингитов у детей с помощью данного экспрессного и классического методов определения энтеровирусов. На описанный выше способ получено авторское свидетельство N от и, в настоящее время, оформляется патент.

Основной новизной предлагаемого комплекса методов является использование ускоренного иммуноферментного теста жидкостного типа для обнаружения и типирования энтеровирусных антигенов в фекалиях и ликворе больных. Предлагаемые методы, в отличие от ранее используемых, позволяют:

- значительно ускорить диагностику энтеровирусных инфекций, особенно с применением иммуноферментного теста, где обнаружение и типирование возможно в течений 24 часов от получения материала;

- для иммуноферментного теста применен оригинальный, патентуемый в настоящее время, способ, где впервые использовано сочетание стандартной реакций связывания комплемента в антигентестируемом варианте с иммуноферментным способом обнаружения остаточного комплемента;

- в предложенном способе в течении одних суток не только устанавливается присутствие в обследуемом материале энтеровирусов, но и дается их количественная характеристика и подтверждается тип обнаруженного энтеровируса;

- предлагаемый способ не требует специального диагностикума, исследования проводятся со стандартными наборами диагностических энтеровирусных сывороток.

Ингредиенты реакции для осуществления иммуноферментного тестирования. В данном экспрессном тесте используют следующие составляющие:

2) Типоспецифические диагностические сыворотки к энтеровирусам групп Коксаки A, B, Экхо, а так же Энтеро 68, 69, 70, 71 и полиомиелита I, II, III типа производства Московского института полиомиелита и вирусных энцефалитов. Сыворотки используют в двухкратном разведении по отношению к титру, указанному в инструкции.

4) Система выявления свободного комплемента на конечном этапе реакции. Теоретической основой выявления свободного комплемента в описываемой модификации экспрессного выявления энтеровирусов, является полученный нами факт усиления каталазной активности эритроцитов при одновременном контакте их с комплементом и гемолитической сывороткой. Поэтому система выявления свободного комплемента слагается из следующих ингредиентов:

- бараньи эритроциты. Суспензия бараньих эритроцитов готовится на мединалово-вероналовом буфере. Концентрация ее рассчитывается в специально проведенном опыте, где 0,1 мл осадка, свежеприготовленных бараньих эритроцитов, добавляют в 10 мл дистиллированной воды с последующим титрованием в 6-7 пробирках с коэффициентом 2. Степень гемолиза учитывается спектрофотометрически при длине волны 410 нМ. Разведение в пробирке, давшей показатель экстинкции в пределах 0,400-0,500 ОЕ, пересчитывается на исходную концентрацию эритроцитов и таким образом приготавливается соответствующее рабочее разведение эритроцитарной суспензии;

- гемолитическая сыворотка. В опыте используется стандартная диагностическая гемолитическая сыворотка для реакции связывания комплемента, производства НПО "Биомед" г. Пермь - 89. Сыворотка перед опытом титруется в стандартной реакции связывания комплемента и используется для составления системы в концентрации соответствующей 1,5-2,0 гемолитическим единицам. Система для учета свободного комплемента приготавливается "ex tempore" непосредственно перед внесением. Для приготовления рабочего раствора соединяют равные объемы приготовленной дозы эритроцитов и гемолитической сыворотки.

Достоверные результаты экспресс-диагностики получают только при четком приготовлении (согласно описанному выше) всех ингредиентов системы выявления свободного комплемента. Даже при незначительном изменении указанного соотношения эритроцитов и гемолитической сыворотки меняются отношения между эндогенной каталазой эритроцитов, каталазной активностью гемоглобина и пероксидазой мембраны эритроцита (каталазный комплекс), что существенно искажает результаты реакции.

5) Смесь для выявления каталазной активности. На последнем этапе реакции выявление каталазного комплекса осуществляется с помощью смеси 0,1% ортофенилендиалина (ОФД) производства фирмы "Сигма" и 3% раствора перекиси водорода в равных количествах.

6) Реактив для остановки реакции. С этой целью в реакцию вводится однонормальная стандартная серная кислота.

Использование набора предлагаемых тестов дает возможность:

- ускорение расшифровки этиологии энтеровирусных вспышек (в частности серозных менингитов у детей);

- быстрая диагностика энтеровирусных серозных менингитов, дающая возможность дифференцировки диагноза с дальнейшем целенаправленным лечением;

- экономии материалов для исследования в связи с исключением из работы этапа тканевых культур (культура ткани, среды, растворы);

- экономия рабочего времени врача и лаборанта, дающее возможность увеличения количества проводимых исследований.

Показаниями к применению предложенных способов является:

- расшифровка вспышек серозных менингитов и других энтеровирусных заболеваний;

- обследование отдельных больных для дифференцировки диагноза.

Противопоказания к использованию рекомендуемого метода практически отсутствуют.