1. Разработаны ФБУН "Московский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского" Роспотребнадзора (А.П. Топтыгина, Т.А. Мамаева, М.А. Смердова, М.А. Наумова, Н.В. Тураева, О.В. Цвиркун, Т.С. Чехляева); ФБУН "Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера" Роспотребнадзора (Н.В. Железнова, М.А. Бичурина).

2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 30 мая 2022 г.

3. Введены впервые.

1.1. В настоящих методических рекомендациях (далее - МР) представлен алгоритм проведения внутреннего контроля качества (далее - ВКК) лабораторных исследований, направленных на выявление специфических антител классов IgM и IgG к вирусу кори методом иммуноферментного анализа (далее - ИФА) с применением внутренних контрольных препаратов (далее - ВКП).

1.2. В МР использована система ВКК, позволяющая определять достоверность получаемых результатов и анализировать с помощью карты Леви-Дженнингса данные, полученные при обследовании больных и переболевших корью, а также привитых против этой инфекции. Алгоритм может применяться при использовании различных контрольных препаратов:

- - собственного изготовления, приготовленных на основе пула положительных сывороток;

- коммерческих препаратов;

- при проведении анализов на тест-системах других производителей.

1.3. МР предназначены для специалистов органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы научными и медицинскими организациями, исследующими гуморальный иммунитет к антигенам вируса кори методом ИФА.

2.1. Контроль качества лабораторных исследований является одной из важнейших составляющих работы современных клинико-диагностических лабораторий. Проведение мероприятий по ВКК является необходимым условием работы лабораторий, входящих в лабораторную сеть Всемирной организации здравоохранения (далее - ВОЗ) по кори и краснухе.

В рамках международной программы по надзору за корью и краснухой организована единая лабораторная сеть, включающая 10 субнациональных лабораторий в Российской Федерации и 10 лабораторий в странах СНГ [6, 7], в задачи которой входит подтверждение диагноза "корь" с использованием единого протокола исследования методом ИФА в соответствии с рекомендациями ВОЗ [8]. Отсутствие единого контрольного препарата при проведении ВКК и появление ложноположительных антител у лиц с аутоиммунными процессами потребовали усовершенствования контроля качества (далее - КК) исследований методом ИФА и увеличения кратности обследования пациентов на этапе элиминации инфекции [9 - 14].

2.2. Данные серологического мониторинга, а также выборочное изучение состояния специфического гуморального иммунитета к вирусу кори методом ИФА позволяют объективно оценить фактическую защищенность от кори лиц декретированных возрастов и профессиональных групп на территориях всех субъектов Российской Федерации в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <1> и методическими документами <2>. При этом особое значение в лабораторных исследованиях имеют вопросы стабильности определения IgG-антител методом ИФА, позволяющие не только получать достоверную информацию, но и сопоставлять результаты разных исследователей [4, 14].

--------------------------------

<1> Пункт 2727 глава XXXV СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней", утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 N 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный N 62500).

<2> МУ 3.1.2943-11 "Организация и проведение серологического мониторинга и состояния коллективного иммунитета к инфекциям, управляемым средствами специфической профилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, корь, краснуха, эпидемический паротит, полиомиелит, гепатит B)", утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 15.07.2011.

2.3. Определение восприимчивости к вирусу кори зависит от чувствительности и специфичности тест-систем, используемых в ИФА, а также от правильности интерпретации полученных результатов с учетом клинических и эпидемиологических данных <3> [4, 8].

--------------------------------

<3> Приказ Минздрава Российской Федерации от 07.02.2000 N 45 "О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации"; ОСТ 91500.13.0001 "Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов", утвержденный приказом Минздрава России от 26.05.2003 N 220.

При наличии случайных и систематических ошибок при проведении лабораторных исследований необходимо проведение процедур КК, одним из составных частей которого является ВКК. Система ВКК является оперативной формой контроля, данные которой свидетельствуют о степени достоверности полученных результатов.

Необходимость введения контрольного препарата для совершенствования системы ВКК исследований по определению антител к вирусу кори количественным и качественным методом ИФА обусловлена наличием нескольких сертифицированных в Российской Федерации тест-систем, различающихся по своим техническим характеристикам, а также наличием нескольких серий в пределах каждой тест-системы в течение одного года, что затрудняет анализ данных в рамках всей страны в течение длительного временного периода.

Имеющиеся в коммерческих наборах для ИФА внутритестовые контроли не обеспечивают выявления всех ошибок, которые могут повлиять на конечный результат. Использование ВКК в ИФА предусмотрено плановыми мероприятиями ВОЗ во всех лабораториях, входящих в международную лабораторную сеть (около 700 лабораторий) по надзору за корью и краснухой [9].

До ноября 2015 года лаборатории, входящие в лабораторную сеть по кори Российской Федерации и стран СНГ, готовили контрольные образцы для проведения ВКК, используя собственный банк положительных сывороток. Положительные сыворотки, обладая разной специфической активностью, не являются стандартными образцами, и использование их с целью КК может влиять на достоверность получаемых результатов.

2.4. Материально-техническое обеспечение метода ИФА с применением ВКП представлено в приложении 1 к настоящим МР.

3.1. При проведении неколичественными методами ИФА каждой серии лабораторных исследований по определению противокоревых антител с помощью ИФА рекомендуется выполнять контрольные измерения, отображать их результаты на контрольных картах Леви-Дженнингса и на основании полученных данных принимать решение о степени достоверности полученных результатов [8].

3.2. ВКК является составной частью КК лабораторных исследований [11, 17].

Основной целью ВКК является выявление, оценка и оперативное устранение ошибок, возникающих в процессе лабораторных исследований. Данные ошибки могут быть связаны со сбоем в используемой аналитической системе, условиями окружающей среды и работой оператора.

Оперативная информация о напряженности специфического иммунитета необходима при расследовании последствий иммунизации и оценки уровня иммунитета населения к кори для проведения дополнительной вакцинации серонегативных лиц в индикаторных группах или ревакцинации.

Для лабораторий, входящих в лабораторную сеть ВОЗ по кори и краснухе, введение и использование в повседневной практике процедур ВКК является обязательным условием получения и продления аккредитации ВОЗ.

3.3. Факторами, влияющими на достоверность результатов при использовании положительных сывороток в качестве контрольных материалов, являются:

- объем образца и/или реагентов;

- качество аналита;

- соблюдение температурных режимов на всех этапах исследования, в том числе при хранении и транспортировке образцов;

- время инкубации и получения результатов;

- правильность записей и передачи результатов;

- тип и качество используемой тест-системы (в частности, тип встроенных в тест-систему контролей);

- проблемы с калибровкой средств измерений;

- особенности работы оператора, проводящего исследования.

- отсутствие стандартного алгоритма проведения мероприятий по ВКК.

3.4. В Российской Федерации разработаны ВКП <4> для исследования IgM-антител к вирусу кори (далее - ВКП-IgM) и IgG-антител (далее - ВКП-IgG) <5>, которые безвозмездно предоставляются в лаборатории, сертифицированные ВОЗ для диагностики кори и краснухи.

--------------------------------

<4> Примечание. Допускается использование препаратов с аналогичными или лучшими характеристиками.

<5> В качестве примера рассмотрены лиофилизированные препараты "ВЛК Корь-IgM" и "ВЛК Корь-IgG".

3.5. Контрольные препараты для ВКК исследований могут быть:

- нативными, приготовленными на основе банка положительных сывороток;

- лиофилизированными, приготовленными промышленным способом для одной лаборатории или лабораторной сети (некоммерческие);

- лиофилизированными, приготовленными промышленным способом и находящимися в свободной продаже (коммерческие).

Условия при проведении ВКК серологических исследований вне зависимости от типа препарата [8]:

- контрольные материалы готовятся из биологического материала, родственного исследуемым образцам;

- рабочий раствор контрольного препарата (цельный или его рабочее разведение) не должен содержать нецелевые маркеры;

- процедура получения рабочего раствора должна быть последовательна (разведение исходного препарата, тестирование цельного препарата и его разведений в ИФА, определение сходимости), а полученные результаты воспроизводимы;

- контрольный препарат исследуется в аналитических сериях и условиях, как пробы пациентов;

- контрольный препарат должен проходить все этапы подготовки к проведению процедуры ВКК при переходе на новую тест-систему.

3.6. Проведение процедуры ВКК осуществляется в соответствии с алгоритмом ВКК исследований IgM и IgG к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольных препаратов согласно приложению 2 к настоящим МР).

Приготовление рабочего раствора контрольных препаратов осуществляется согласно инструкции по их использованию. Контрольный препарат готовится в достаточном для проведения ВКК количестве.

Этапы приготовления и использования рабочего раствора контрольного препарата:

1) выбор рабочего разведения контрольного препарата осуществляют его двукратным титрованием с применением отрицательной донорской сыворотки (далее - ОДС) и тестированием полученных образцов методом ИФА. Подобранное рабочее разведение контрольного препарата должно находиться в диапазоне 2 - 3 cut off <6> (о.е.) в случае определения IgM или в диапазоне 0,5 - 1,5 о.е. при определении IgG;

2) после выбора рабочего разведения контрольного препарата (он может быть цельным, если отвечает вышеуказанным условиям) переходят к процедуре ВКК. Исследуют внутрисерийную сходимость результатов измерений контрольного препарата путем оценки результатов измерений 10 независимых проб подобранного ранее рабочего раствора контрольного препарата методом ИФА в одной аналитической серии на одном планшете с расчетом коэффициента вариации (CV₁₀) по формулам (приложение 3 к настоящим МР). Показатель CV₁₀ контрольного препарата не должен превышать 8% по ГОСТ Р 53133.1 - 4;

3) при выполнении правила CV₁₀ < 8% контрольный препарат (цельный или его рабочее разведение) разливают по 20 мкл (объем, достаточный на одну постановку ИФА), замораживают и хранят при температуре (от минус 25 °C до минус 30 °C) не более 3 мес;

4) оценивается воспроизводимость результатов по результатам измерений 20 проб цельного или выбранного рабочего разведения контрольного препарата в разных аналитических сериях методом ИФА с расчетом коэффициента вариации (CV₂₀) по ГОСТ Р 53133.1 - 4 (приложение 3 к настоящим МР). Результаты могут быть получены одним оператором в течение 20 дней, или 10 дней при проведении 2 измерений в день, или несколькими сотрудниками, которые обычно выполняют анализ в лаборатории;

5) по результатам измерений 20 проб рабочего раствора контрольного препарата с использованием формул (приложение 3 к настоящим МР) строят контрольную карту Леви-Дженнингса. Алгоритм построения контрольной карты представлен в приложении 4 к настоящим МР. Контрольная карта используется для осуществления оперативного (текущего) контроля качества результатов исследования образцов. С этой целью в каждой аналитической серии образцов исследуют готовый контрольный образец с соблюдением процедур, предусмотренных инструкцией к тест-системе;

6) интерпретацию результатов проводят с использованием правил Вестгарда <7> (приложение 5 к настоящим МР). Правила Вестгарда [18] предназначены для проверки стабильности работы аналитической системы и используются при оценке приемлемости результатов анализа образцов.

--------------------------------

<6> Cut off или отсечка - уровень оптической плотности (в единицах оптической плотности), отсекающий отрицательное и положительное значение при тестировании проб сыворотки крови.

<7> Правила Вестгарда позволяют регистрировать отклонение полученного значения протестированного контрольного препарата в пределах колебания среднеквадратического отклонения (S) +/- 2S или +/- 3S, а также позволяют установить систему отслеживания динамики таких отклонений в указанном промежутке.

Для использования правил Вестгарда соблюдаются следующие условия:

1) рабочий раствор контрольного препарата должен соответствовать используемой тест-системе и положениям, изложенным в п. 3.4;

2) карта Леви-Дженнингса должна представлять собой графическую систему, где среднее значение рабочего раствора контрольного препарата и среднеквадратические отклонения (S) были определены на основе 20 повторных измерений рабочего раствора контрольного препарата с помощью используемой тест-системы;

3) учет результатов, полученных методом ИФА, может осуществляться только при соблюдении критериев валидации внутритестовых контролей, установленных производителем используемой тест-системы.

Система правил Вестгарда применяется для интерпретации карт Леви-Дженнингса с двумя или более контролями в каждой аналитической серии, но она может быть использована и в исследованиях с одним контролем. Если результат тестирования контрольного препарата нарушает правила Вестгарда, причины такого отклонения должны быть расследованы и, при необходимости, исследование проведено повторно.

--------------------------------

<8> В качестве примера рассмотрены лиофилизированные препараты "ВЛК Корь-IgM" и "ВЛК Корь-IgG".

4.1. Характеристика контрольных препаратов ВКП-IgM и ВКП-IgG, используемых для примера проведения внутреннего контроля качества лабораторных исследований на наличие специфических IgM и IgG антител к вирусу кори методом ИФА:

- ВКП-IgM - лиофилизированный контрольный препарат для оценки качества лабораторных исследований на наличие специфических антител класса M к вирусу кори;

- ВКП - лиофилизированный контрольный препарат для оценки качества лабораторных исследований на наличие специфических антител класса G к вирусу кори.

Дополнительно используется препарат ОДС, представляющий собой отрицательную донорскую сыворотку, не содержащую IgM/IgG к вирусу кори, который используется для приготовления разведений контрольных препаратов ВКП-IgM и ВКП-IgG.

ВКП-IgM и ВКП-IgG, а также ОДС изготавливают на основе сыворотки крови человека, инактивированной прогреванием (56 °C в течение 1 часа). Препараты не должны содержать HBsAg, антител к ВГС, T. Pallidum, ВИЧ-1,2, антиген p24 ВИЧ-1.

Примеры показателей специфической активности препаратов, полученных при аттестации контрольных препаратов с использованием тест-систем разных форматов ("indirect" и "capture"), приводятся в табл.

--------------------------------

<9> Показатели специфической активности (ОП, о.е.) для IgM и (ОП, о.е.) и значения МЕ/мл для IgG в контрольных препаратах (ВКП-IgM и ВКП-IgG) были определены при проведении 24 измерений каждого образца [13].

Для возможности использования наборов разной модификации и разных производителей рекомендуется использовать оптическую плотность (далее - ОП) рабочего раствора контрольного препарата (цельного или его разведения) для неколичественного метода определения IgM в интервале 2 - 3 cut off (о.е.) используемой тест-системы [14].

4.2. Оценка качества лабораторных исследований на наличие специфических антител класса M к вирусу кори с применением контрольного препарата ВКП-IgM и проведение процедур ВКК осуществляется в соответствии с приложением 2 к настоящим МР.

4.3. Оценка качества лабораторных исследований на наличие специфических антител класса G к вирусу кори качественным и количественным методом ИФА с использованием контрольного препарата ВКП-IgG осуществляется в соответствии с приложением 2 к настоящим МР.

--------------------------------

<10> Примечание. Допускается использование препаратов и оборудования с аналогичными или лучшими характеристиками.

- тест-системы для определения концентрации антител к вирусу кори методом ИФА, зарегистрированные в Российской Федерации в установленном порядке <11>;

- ВКП-IgM - лиофильно высушенный препарат, содержащий IgM к вирусу кори;

- ВКП-IgG - лиофильно высушенный препарат, содержащий IgG к вирусу кори;

- ОДС - лиофильно высушенная отрицательная донорская сыворотка;

- вода дистиллированная.

--------------------------------

<11> Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий".

- ламинарный бокс с биологической защитой 2-го класса;

- термостатируемый шейкер для планшетов;

- спектрофотометр, позволяющий проводить измерения оптической плотности растворов в лунках планшета в двухволновом режиме: при основной длине волны 450 нм и длине волны сравнения в диапазоне 620 - 655 нм;

- термостат, поддерживающий температуру (37 +/- 1) °C;

- дозаторы полуавтоматические одноканальные и многоканальные с переменным или фиксированным объемом со сменными наконечниками, позволяющими отбирать объемы жидкости от 5 до 1000 мкл;

- промыватель планшетов ручной или автоматический;

- вортекс для перемешивания содержимого пробирок;

- флаконы стеклянные вместимостью 15 мл;

- бумага фильтровальная лабораторная;

- цилиндр мерный 2-го класса точности вместимостью 1000 мл.

1. Алгоритм внутрилабораторного контроля качества исследований IgM к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольных препаратов включает в себя следующие этапы:

1.1. Лиофилизированный контрольный препарат ВКП-IgM необходимо восстановить добавлением 200 мкл дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

1.2. Приготовить 2-кратные разведения контрольного препарата ВКП-IgM от 1:2 до 1:128 с использованием ОДС для исследования в 4 параллелях. Разведения тщательно перемешать на вортексе.

1.3. Провести ИФА с применением полученных разведений контрольного препарата ВКП-IgM, согласно инструкции к используемой тест-системе.

1.4. Используя полученные данные, вычислить средний показатель ОП для 4 значений каждого из разведений ВКП-IgM.

1.5. По результатам построить график, где на оси ординат (Y) откладывают средние значения ОП разведений контрольного препарата ВКП-IgM, на оси абсцисс (X) - разведения контрольного препарата ВКП-IgM.

1.6. Определить рабочее разведение контрольного препарата ВКП-IgM, которое устанавливается с помощью построенного графика. Для этого вычисляют значения ОП, равные 2 - 3 значениям cut off. Любое разведение контрольного препарата, находящееся в данном диапазоне ОП, может быть определено как рабочее.

Пример определения разведений препарата ВКП-IgM с использованием тест-систем двух форматов - "indirect" и "capture" - указан на рисунке 2.1.

Примечание: пунктирные линии, пересекающие кривую линию зависимости активности контрольного препарата от его разведения, на оси ординат (Y) показывают значение ОП разведения контрольного препарата, а на оси абсцисс (X) - разведение.

Для тест-системы "indirect"-формата разведение контрольного препарата ВКП-IgM 1:10 (ОП = 0,96 о.е.), специфическая активность которого находится в диапазоне 2 - 3 x ОП_пор. (0,76 - 1,14 о.е.), является рабочим разведением (далее - рабочий раствор).

Для тест-системы "capture"-формата разведение контрольного препарата ВКП-IgM 1:2 (ОП = 0,56 о.е.), специфическая активность которого находится в диапазоне 2 - 3 x cut off (0,4 - 0,6 о.е.), является рабочим разведением (далее - рабочий раствор).

1.7. Провести оценку внутрисерийной сходимости результатов путем анализа 10 проб каждого подобранного рабочего разведения для каждой тест-системы.

1.8. На основе полученных результатов рассчитать показатель CV₁₀ по формуле (см. приложение 3 к настоящим МР).

Пример результатов определения сходимости значений рабочего раствора ВКП-IgM, полученных с помощью тест-систем разных форматов: "indirect" - CV = S/Xср x 100% = 4,616%; "capture" - CV = S/Xср x 100% = 7,009% - указан в таблице 2.1.

1.9. Определить воспроизводимость значения путем анализа результатов 20 проб рабочего разведения ВКП-IgM. Варианты получения значений 20 проб (см. подпункт 4 пункта 3.6).

В качестве примера приведем данные, полученные с помощью тест-систем двух форматов: "indirect" и "capture" (табл. 2.2).

1.10. На основе полученных результатов рассчитать показатель CV₂₀ по формуле (приложение 3 к настоящим МР).

Пример: показатели CV₂₀ рабочего раствора контрольного препарата ВКП-IgM по результатам, полученным с помощью тест-систем "indirect"- и "capture"-формата, составляют 13,87% и 12,595% соответственно и не превышают 14,2%, что позволяет приступить к построению контрольной карты.

1.11. Рассчитать среднюю арифметическую величину Xср, среднеквадратическое отклонение S, контрольные пределы: Xср +/- 1S, Xср +/- 2S и Xср +/- 3S.

Пример рассчитанных значений контрольных показателей рабочего раствора ВКП-IgM для тест-систем "indirect"- и "capture"-формата, необходимых для построения контрольной карты Леви-Дженнингса, указан в таблице 2.3.

1.12. Построить контрольные карты Леви-Дженнингса (приложение 4 к настоящим МР).

Пример: на рис. 2.2 представлена контрольная карта и результаты оперативного контроля ВКП-IgM в разведении 1:10, который подвергался процедурам, предусмотренным инструкцией для исследуемых образцов при постановке тест-системы "indirect"-формата.

Показатели ОП рабочего раствора ВКП-IgM нанести на карту, на оси абсцисс (X) которой находится номер исследования (в реальном режиме - дата исследования), а на оси ординат (Y) - значения определяемого контрольного раствора ОП (о.е.).

1.13. Результаты работы аналитической системы оценить в соответствии с правилами Вестгарда (см. приложение 5 к настоящим МР).

1.14. В результате при использовании контрольного препарата ВКП-IgM, предлагаемого в данном примере, для оценки качества лабораторных исследований на наличие специфических антител класса M к вирусу кори рекомендовано рабочее разведение 1:10 для тест-системы "indirect"-формата и разведение 1:2 для тест-системы "capture"-формата.

2. Алгоритм внутрилабораторного контроля качества исследований IgG-антител к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольных препаратов включает в себя следующие этапы:

2.1. Лиофильно высушенный препарат ВКП-IgG, содержащий IgG к вирусу кори, восстановить добавлением 200 мкл дистиллированной воды и тщательно перемешать.

2.2. Приготовить 2-кратные разведения контрольного препарата с 1:2 до 1:8 с использованием ОДС, тщательно перемешать на вортексе.

2.3. Осуществить тестирование в ИФА приготовленных разведений, включая исходный цельный препарат в трех повторах.

2.4. Используя полученные данные, вычислить средний показатель ОП для 3 повторов исходного препарата и каждого разведения, после чего построить график, где ось ординат (Y) - средние значения ОП; ось абсцисс (X) - степень разведения образца.

2.5. Далее выбрать рабочее разведение контрольного препарата.

В качестве примера: результаты исследования ВКП-IgG с использованием тест-системы 1 и тест-системы 2, сертифицированных в Российской Федерации (рис. 2.3), показали, что поскольку в тест-системе 1 за величину cut-off принято значение калибратора 0,15 МЕ/мл, соответствующее ОП = 0,108 о.е., то условиям, принятым для контрольного материала на IgM в 2 - 3 cut-off, удовлетворяет разведение 1:2 (ОП = 0,312 о.е.). Данное значение находится в нелинейном участке калибровочной кривой, в котором резко возрастает погрешность измерения, и не удовлетворяет условию нахождения в диапазоне ОП 0,5 - 1,5 о.е., принятом для контрольных препаратов на IgG [17]. Этому условию удовлетворяет цельный контрольный образец (ОП = 0,814 о.е.), так как определяемые значения оказываются в линейной области калибровочной кривой.

Рассчитанная концентрация контрольного препарата для исследования IgG-антител не должна находиться в зоне значений (точек) калибровочных образцов, входящих в состав набора реагентов, по которым строится калибровочный график от точки к точке. Было доказано, что попадание значения контрольного образца в область точки калибратора резко повышает значение коэффициента вариации [20]. При тестировании ВКП-IgG получили ОП = 0,814 о.е., что соответствует 0,81 +/- 0,13 МЕ/мл, следовательно он не попадает на точки калибраторов с концентрацией 0,5 и 1 МЕ/мл, что важно при проведении исследования количественным способом. В тест-системе 2 за величину cut-off принято значение калибратора 0,15 МЕ/мл, соответствующее ОП = 0,433 о.е.

Условиям, принятым для контрольного материала на IgM в 2 - 3 cut-off, не удовлетворяет даже цельный контрольный образец, так как в этой тест-системе его ОП = 0,765 о.е., что составляет лишь 1,8 cut-off. ОП цельного контрольного образца удовлетворяет условию нахождения в диапазоне ОП 0,5 - 1,5 о.е., а рассчитанная концентрация ВКП-IgG составляет в этой тест-системе 0,72 МЕ/мл, следовательно, он не попадает на точки калибраторов. В результате проведенных исследований было показано, что для оценки сходимости результатов, построения контрольных карт и проведения оперативного контроля при исследовании IgG-антител критерий в 2 - 3 cut-off не подходит. Следует ориентироваться на критерий попадания ОП контрольного препарата (цельного или его разведения) в диапазон 0,5 - 1,5 о.е. и непопадания на точки калибраторов при количественном методе оценки результатов.

В качестве примера представлены исследования с применением ВКП-IgG в тест-системе 1, зарегистрированной в Российской Федерации. В данном случае цельный препарат ВКП-IgG удовлетворяет критерию попадания измеренной ОП в интервал 0,5 - 1,5 о.е. и не попадает в зону точек калибратора.

2.6. Оценить внутрисерийную сходимость результатов 10 измерений контрольного препарата ВКП-IgG в одной аналитической серии методом ИФА.

2.7. На основе полученных результатов рассчитать показатель CV₁₀ по формуле (приложение 3 к настоящим МР). Результаты можно учитывать двумя способами: качественным в ОП (о.е.) и количественным (МЕ/мл).

В таблице 2.4 представлен пример 10 измерений контрольного препарата ВКП-IgG.

2.8. Результаты расчетов определения сходимости значений ВКП занести в таблицу. Шаблон таблицы для внесения результатов сходимости измерений ВКП представлен в приложении 6 к настоящим МР.

Показатели CV₁₀ контрольного препарата не должны превышать 8% (см. подпункт 2 пункта 3.6). В рассматриваемом примере CV₁₀ для качественного учета ОП (о.е.) оказался равным 7,1%, а для количественного учета (МЕ/мл) 7,15%. Рассчитанные характеристики удовлетворяют заданному критерию в 8%, что позволяет перейти к следующему этапу. Если полученное значение CV₁₀ превышает 8%, следует найти причину и устранить ее.

2.9. Далее провести оценку воспроизводимости результатов путем анализа тестирования 20 проб цельного контрольного препарата ВКП-IgG методом ИФА (варианты получения значений 20 проб аналогичны указанным для случая ВЛК на IgM-корь, см. подпункт 4 пункта 3.6).

2.10. Используя полученные результаты, рассчитать значения CV₂₀, среднюю арифметическую величину Xср, среднеквадратическое отклонение S, контрольные пределы: Xср +/- 1S, Xср +/- 2S и Xср +/- 3S по формулам (приложение 3 к настоящим МР).

Рассчитанные параметры рассматриваемого примера, необходимые для построения контрольной карты Леви-Дженнингса, представлены в табл. 2.5.

Значение CV₂₀ не должно превышать 19%. В рассмотренном примере полученные значения для качественного способа составили 18,412%, а для количественного способа определения IgG - 16,74%, что в обоих случаях удовлетворяет требованию. Следовательно, полученные результаты позволяют построить контрольные карты Леви-Дженнингса для качественного ОП (о.е.) и, при необходимости, количественного (МЕ/мл) способов определения IgG-антител к кори методом ИФА соответственно (см. приложение 4 к настоящим МР).

2.11. Построенные контрольные карты использовать для осуществления оперативного (текущего) контроля качества результатов исследования образцов на предмет выявления IgG-антител к вирусу кори методом ИФА. С этой целью в каждой аналитической серии в одной лунке исследовать препарат ВКП-IgG, который подвергается всем процедурам, предусмотренным инструкцией для исследуемых образцов, и измерить показатель оптической плотности (качественная оценка) или рассчитать концентрацию ВЛК (количественная оценка результатов). Полученные результаты нанести на контрольную карту с указанием даты постановки вручную или используя стандартный пакет программ.

2.12. Стабильность работы аналитической системы оценивать согласно правилам Вестгарда [18] (приложение 5 к настоящим МР).

На рис. 2.4 и 2.5 представлены в качестве примера заполненные контрольные карты по результатам измерения ВКП-IgG количественным и качественным способом методом ИФА.

Примечание: ось ординат (Y) - результаты тестирования контрольного препарата при каждом эксперименте; ось абсцисс (X) - номер опыта (в реальном режиме следует ставить дату проведения эксперимента).

Примечание: ось ординат (Y) - результаты тестирования контрольного препарата при каждом эксперименте; ось абсцисс (X) - номер опыта (в реальном режиме следует ставить дату проведения эксперимента).

Результаты измерений ВКП-IgG находились в соответствии с контрольными правилами, что свидетельствует о правильности проведения исследования IgG-антител к вирусу кори методом ИФА.

3. Алгоритм внутрилабораторного контроля качества исследований IgM- и IgG-антител к вирусу кори методом ИФА с использованием контрольных препаратов представлен на схеме (рис. 2.6).

1. Для расчета среднего значения Xср (1), среднеквадратического отклонения S (2), коэффициента вариации CV (3) образцов следует использовать формулы:

где: Xi - результат конкретного i-го измерения из n выполненных в ОП (о.е.) или концентрация (МЕ/мл);

Xср - среднее значение ОП (о.е.) или концентрация (МЕ/мл);

n - общее количество измерений;

S - среднеквадратическое отклонение ОП (о.е.) или концентрация (МЕ/мл);

CV - коэффициент вариации ОП (о.е.) или концентрация (МЕ/мл).

1. Карта Леви-Дженнингса - графическая система, позволяющая представить результаты анализа контрольных образцов при проведении исследований ежедневно, а также при проведении исследований на разных аналитических сериях, в сравнении с величиной средней арифметической Xср и среднеквадратического отклонения S, рассчитанных на основе 20 повторных измерений контрольного образца.

2. Для построения карты Леви-Дженнингса необходимо: рассчитать ОПср. для качественного учета результатов или МЕ/мл для количественного учета результатов, рассчитать среднюю концентрацию, их среднеквадратические отклонения S, его контрольные пределы +/- 1S, +/- 2S, +/- 3S и коэффициент вариации CV₂₀ по формулам, представленным в приложении 2 к настоящим МР.

3. Затем данные, полученные согласно п. 2, представить на графике, через середину оси ординат которого проводят линию, соответствующую средней арифметической величине Xср, и параллельно этой линии отмечаются линии, соответствующие контрольным пределам:

Xср +/- 1S - контрольный предел - "1 среднеквадратическое отклонение";

Xср +/- 2S - контрольный предел - "2 среднеквадратических отклонения";

Xср +/- 3S - контрольный предел - "3 среднеквадратических отклонения".

4. По оси абсцисс откладываются даты проведения эксперимента.

5. Расчеты могут быть выполнены с использованием компьютерных программ.

6. Образец карты Леви-Дженнингса представлен на рис. 4.1.

1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения".

2. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 N 1416 "Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий".

3. СанПиН 3.3686-21 "Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней".

4. МУ 3.1.2943-11 "Организация и проведение серологического мониторинга и состояния коллективного иммунитета к инфекциям, управляемым средствами специфической профилактики (дифтерия, столбняк, коклюш, корь, краснуха, эпидемический паротит, полиомиелит, гепатит B)".

5. ГОСТ Р 53133.1 - 4 "Технологии лабораторные клинические. Контроль качества клинических лабораторных исследований".

6. Национальный план мероприятий по реализации программы "Элиминация кори и краснухи, достижение спорадической заболеваемости эпидемическим паротитом в Российской Федерации (2021 - 2025 гг.)".

7. Тихонова Н.Т., Мамаева Т.А., Шульга С.В., Ежлова Е.Б., Лыткина И.Н., Цвиркун О.В., Герасимова А.Г. Лабораторное обеспечение Программы ликвидации эндемичной кори в Российской Федерации // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2011. N 1. С. 36 - 39.

8. WHO. Manual for the Laboratory-based Surveillance of Measles, Rubella, and Congenital Rubella Syndrome; 3nd ed. Geneva. Switzerland: WHO, 2018.

9. European Centre for Disease Prevention and Control (ECDC). Epidemiological update: Measles - monitoring European outbreaks, 7 July 2017. Stockholm: ECDC; [Accessed 31 Aug 2017]. Available from: https://ecdc.europa.eu/en/news-events/epidemiological-update-measles-monitoring-european-outbreaks-7-july-2017.

10. Filia A., Bella A., Del Manso M., Baggieri M., Magurano F., Rota M.C. Ongoing outbreak with well over 4,000 measles cases in Italy from January to end August 2017 - what is making elimination so difficult? Euro Surveill. 2017. Vol. 22 (37), P. 30614.

11. World Health Organization Regional Office for Europe (WHO/Europe). Fifth Meeting of the European Regional Verification Commission for Measles and Rubella Elimination (RVC) 24 - 26 October 2016, Copenhagen, Denmark. Copenhagen: WHO/Europe; [Accessed 31 Aug 2017]. Available from: http://www.euro.who.int/_data/assets/pdf_file/0005/330917/5th-RVC-meeting-report.pdf?ua=1.

12. Топтыгина А.П., Мамаева Т.А., Алешкин В.А. Особенности специфического гуморального иммунного ответа против вируса кори // Инфекция и иммунитет. 2013. Т. 3. N 3. С. 243 - 250.

13. Цвиркун О.В., Герасимова А.Г., Тихонова Н.Т., Ежлова Е.Б., Мельникова А.А., Дубовицкая Е.Л., Орлова А.А., Басов А.А., Фролов Р.А. Заболеваемость корью в разных возрастных группах в период элиминации инфекции // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2017. Т. 16. N 3. С. 18 - 25.

14. Мамаева Т.А., Железнова Н.В., Наумова М.А., Говорухина М.В., Калашикова Н.А., Бичурина М.А., Мукомолов С.Л. Алгоритм лабораторного подтверждения и дифференциальной диагностики коревой инфекции в период элиминации кори в Российской Федерации // Инфекция и иммунитет. 2015. Т. 5. N 1. С. 55 - 62.

15. Голева О.В., Самойлова И.Г., Мурина Е.А., Мундруева А.А. Особенности противокоревого иммунитета у населения Санкт-Петербурга // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2012. N 6. С. 25 - 29.

16. Топтыгина А.П., Смердова М.А., Наумова М.А., Владимирова Н.П., Мамаева Т.А. Влияние особенностей популяционного иммунитета на структуру заболеваемости корью и краснухой // Инфекция и иммунитет. 2018. Т. 8. N 3. С. 341 - 348.

17. Нетесова И.Г., Бобкова М.Р. Проведение внутрилабораторного контроля качества неколичественных методов иммуноферментного анализа // Справочник заведующего КДЛ. 2011. N 6. С. 9 - 15.

18. Westgard, J.O. Design of internal quality control for reference value studies // Clin Chem Lab Med 2004. Vol. 42. P. 863 - 867.

19. Мамаева Т.А., Железнова Н.В., Наумова М.А., Чехляева Т.С., Воробейчиков Е.В., М. Бен Маму, Алешкин В.А. Совершенствование контроля качества исследований методом ИФА при лабораторном подтверждении кори и краснухи на этапе элиминации этих инфекций // Инфекция и иммунитет. 2017. Т. 7. N 1. С. 69 - 78.

20. Смердова М.А., Мамаева Т.А., Наумова М.А., Корецкий К.А., Иванов Д.С., Топтыгина А.П. Опыт проведения внутрилабораторного контроля качества при определении антител класса G к вирусу кори методом иммуноферментного анализа с помощью контрольного материала // Российский иммунологический журнал. 2019. Т. 13 (22). N 4. С. 1402 - 1410.