Центральный ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Минздрава СССР.

Ленинградский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови Минздрава СССР.

Авторы: Заслуженный деятель науки РСФСР, проф. В.А. Аграненко, канд. мед. наук В.Л. Голубева, канд. биол. наук В.М. Трошина, канд. биол. наук Р.И. Волкова, канд. мед. наук И.А. Суворова, канд. биол. наук Н.Н. Тибилова, канд. биол. наук Н.А. Маркова, В.Л. Балезина, врач СПК ЦНИИГПК М.И. Демичева, канд. мед. наук Г.Л. Ермакова, док. мед. наук В.В. Мельникова, канд. мед. наук Г.Г. Платонова.

Рецензенты: Заслуженный врач РСФСР Е.М. Макарова, док. мед. наук Л.И. Федорова.

Председатель экспертной комиссии: док. мед. наук Н.А. Горбунова.

Трансфузии эритроцитной массы, обедненной лейкоцитами и тромбоцитами (ЭМОЛТ), показаны сенсибилизированным больным, имеющим лейкоцитарные, тромбоцитарные антитела, с целью предупреждения негемолитических посттрансфузионных реакций, а также для предупреждения аллоиммунизации больных при проведении повторной (или длительной) гемотерапии.

Обедненной считается эритроцитная масса (ЭМ), из которой удалено 70 и более лейкоцитов от исходного количества в цельной крови. Многочисленными исследованиями установлен порог числа переливаемых с дозой ЭМ лейкоцитов (0,5·10⁹), снижение которого позволяет в большинстве случаев предупредить возникновение температурных посттрансфузионных реакций у больных при повторных переливаниях.

Одним из самых эффективных методов получения ЭМОЛТ является криоконсервирование эритроцитов с последующим их размораживанием и отмыванием от криофилактиков. Этот метод позволяет получать трансфузионную среду практически полностью (на 98% и более), освобожденную от лейкоцитов и тромбоцитов. Переливание эритроцитов, заготовленных таким способом, оказывает наиболее благоприятное действие на больных, сенсибилизированных к антигенам лейкоцитов и тромбоцитов, но нуждающихся в повторных гемотрансфузиях. Однако этот метод является трудоемким и дорогостоящим, поэтому его применение доступно лишь для немногих крупных учреждений Службы крови, имеющих криологическое оборудование.

В настоящее время в Службе крови используется метод пятикратного отмывания ЭМ изотоническим раствором хлорида натрия от лейкоцитов и тромбоцитов, который является весьма трудоемким и не обеспечивает достаточно высокую (до 70% и более) степень освобождения ЭМ от этих клеток.

Настоящей инструкцией предлагается несколько методов заготовки ЭМОЛТ, что обусловлено возможностями учреждений Службы крови и использованием ими различных программ фракционирования крови, в рамках которых должна быть предусмотрена и заготовка ЭМОЛТ.

Предпочтительно использовать консервированную кровь, хранившуюся в течение 2 - 7 суток, что обеспечивает возможность максимального ее обеднения лейкоцитами при минимальном (двухкратном) количестве отмываний.

Концентрация оставшихся лейкоцитов в ЭМОЛТ, полученной предлагаемыми методами, не превышает 0,8·10⁶ в 1 мл, что соответствует удалению 90 - 95% этих клеток. Тромбоциты практически отсутствуют.

Методы гарантируют морфофункциональную сохранность отмытых эритроцитов, которые разрешается хранить при температуре 4 +/- 2 °C и использовать течение 24 часов.

Для заготовки ЭМОЛТ рекомендуется производить центрифугирование крови и отмываемых эритроцитов при 5 +/- 2 °C.

В случае использования свежезаготовленной (4 - 6 часов) консервированной крови для фракционирования с целью получения концентрата тромбоцитов и лейкоцитов ее центрифугирование производят при температуре 22 °C +/- 2.

В качества отмывающего раствора применяют стерильный апирогенный 0,9% раствор хлорида натрия (без антибиотиков).

Заготовку ЭМОЛТ производят по предварительным заявкам лечебных учреждений.

1.1.1. Кровь от доноров заготавливают в стеклянные бутылки вместимостью 250 мл <*> на гемоконсервантах Глюгицир и Цитроглюкофосфат.

--------------------------------

<*> Стеклянные бутылки вместимостью 450 или 500 мл (ГОСТ 20782-77) не рекомендуются для заготовки ЭМОЛТ ввиду значительного боя этих бутылок в процессе центрифугирования.

1.1.2. Бутылки с кровью, хранившейся в течение 1 - 7 суток после взятия крови от донора при 4 °C, помещают в центрифужные стаканы с резиновыми вкладышами, уравновешивают попарно водой и центрифугируют при центробежном ускорении 1700 g в течение 11 минут (см. таблицу режимов) при температуре 5 +/- 2 °C.

Примечание. Перед центрифугированием кровь в бутылках тщательно и осторожно перемешивают, чтобы клетки равномерно распределились в плазме.

1.1.3. После полной остановки центрифуги бутылки с кровью осторожно (не нарушая расслоения клеток и плазмы) вынимают из центрифужных стаканов, переносят в предбокс, удаляют с тубусов парафин, обжигают горла бутылок горячим ватным шариком, смоченным в спирте и передают в бокс.

1.1.4. В боксе резиновые пробки и колпачки на бутылках обжигают вторично и прокалывают двумя иглами: иглой-воздуховодом и длинной иглой, соединенной резиновой трубкой с бутылкой, в которую собирается плазма. Длинную иглу вводят в бутылку до погружения ее в слой плазмы.

1.1.5. Отделение плазмы производят путем ее перемещения в другую бутылку с помощью вакуумного отсоса или подачи в бутылку с кровью стерильного воздуха под давлением. Аспирацию плазмы заканчивают, когда над эритроцитами останется слой плазмы высотой около 1 см (15 - 20 мл). Оставшуюся плазму и слой лейкоцитов с подлежащими эритроцитами высотой около 1 см (15 - 20 мл) переводят в другую стерильную бутылку.

Выделенную плазму в соответствии с действующей НТД направляют на замораживание, приготовление криопреципитата или препаратов плазмы; лейкоциты - на приготовление интерферона или при отсутствии потребности не используют.

1.1.6. К оставшимся эритроцитам по стерильной системе прибавляют изотонический раствор хлорида натрия (заполняя бутылку доверху), тщательно перемешивают и центрифугируют при режиме 2000 g в течение 5 мин. при температуре 5 +/- 2 °C (см. таблицу режимов).

1.1.7. После центрифугирования бутылки осторожно переносят в бокс, вновь обжигают поверхность пробки и горло горящим спиртом и удаляют с помощью отсоса надстой раствора хлорида натрия с остатками лейкоцитов, располагающихся слоем сероватого цвета на поверхности эритроцитов, и подлежащими эритроцитами высотой около 0,5 см (около 10 мл).

1.1.8. Повторяют процедуру отмывания еще два раза, если использовалась свежезаготовленная консервированная кровь (до 1 суток хранения), или один раз, если кровь хранилась 2 - 7 суток.

1.1.9. Пробку бутылки с ЭМОЛТ смазывают 5% йодной настойкой и герметизируют стерильным расплавленным парафином.

1.1.10. На бутылку с эритроцитами, полученными после 3- или 2-кратного отмывания, поверх этикетки для крови наклеивают этикетку, на которой указывают учреждение-изготовитель, "Эритроциты, обедненные лейкоцитами и тромбоцитами", количество в мл, дату заготовки крови, дату отмывания, группу крови и резус-фактор, фамилию донора и врача, производившего отмывание, срок хранения ЭМОЛТ - 24 часа при 4 +/- 2 °C.

1.1.11. Для контроля стерильности производят бактериологический посев ЭМОЛТ из одной бутылки от каждой серии, заготовленной в один день; если серия состоит из 20 и более бутылок, посев производят из каждой 20-й бутылки с отмытыми эритроцитами.

Из 250 мл крови получают 75 - 90 мл ЭМОЛТ.

1.2.1. Консервированная кровь, заготовленная в полимерные контейнеры "Гемакон" 500, "Гемакон" 500/300 или "Гемакон" 500/300/300, после заготовки от донора и не позднее 4 - 6 часов хранения при комнатной температуре может подвергаться фракционированию на компоненты или ее оставляют на хранение при 4 +/- 2 °C.

Для получения ЭМОЛТ может быть использована кровь сразу после заготовки (параллельно с выделением концентратов тромбоцитов (КТ), лейкоцитов (КЛ) и плазмы) и кровь 2 - 7 суток хранения.

1.2.2. Контейнеры с консервированной кровью, предназначенной для получения ЭМОЛТ, после тщательного медленного перемешивания помещают в центрифужные стаканы, уравновешивают (резиновой крошкой или другим сухим материалом) и центрифугируют при центробежном ускорении 1250 g в течение 20 минут (см. таблицу режимов). При использовании свежезаготовленной крови (не более 4 - 6 часов хранения), предназначенной в первую очередь для заготовки концентратов тромбоцитов и лейкоцитов, устанавливают для центрифугирования температуру 22 +/- 2 °C. Хранившуюся кровь центрифугируют при 5 +/- 2 °C. При этом режиме эритроциты оседают на дно контейнера, над ними располагается лейкоцитарно-тромбоцитарный слой (ЛТС) серовато-белого цвета, поверх которого находится бедная клетками плазма.

1.2.3. После остановки центрифуги контейнер с кровью (N 1), соединенный с другими пустыми контейнерами N 2 и N 3 (контейнеры "Гемакон" 500/300/300 или "Гемакон" 500/300), осторожно вынимают из центрифуги, передают в бокс и помещают в плазмоэкстрактор этикеткой, обращенной к задней его пластине. При заготовке крови в контейнер "Гемакон" 500 в штуцер контейнера N 1 вводят иглу контейнера "Компопласт" 300/300.

1.2.4. Нажимают передней подвижной пластиной плазмоэкстрактора на контейнер с кровью. Ослабляют зажим на соединительной трубке между контейнерами N 1 и N 2 и переводят плазму в контейнер N 2. Когда в контейнере N 1 над эритроцитами останется слой плазмы высотой 2 - 3 см (объемом около 40 - 50 мл) (при фракционировании крови, предназначенной для выделения КТ) на соединительную трубку накладывают зажим на расстоянии 2 - 5 см от контейнера N 2. При заготовке ЭМОЛТ из хранившейся крови, не предназначенной для выделения КТ, зажим на соединительную трубку между контейнерами накладывают, когда граница между плазмой и эритроцитами окажется у выходного отверстия контейнера N 1.

1.2.5. Оставшуюся плазму, ЛТС вместе со слоем подлежащих эритроцитов высотой около 1 см (общим объемом 30 - 40 мл) переводят во второй дополнительный контейнер или присоединенный "Компопласт" (N 3).

Примечание. При выделении ЛТС из крови, хранившейся более 2-х суток, из-за возможного прилипания лейкоцитов к стенкам контейнера, допустимо выдавливание ЛТС из контейнера вручную.

1.2.6. На соединительную трубку на расстоянии 2 - 5 см от контейнера N 1 и на таком же расстоянии от контейнера N 3 накладывают зажим. Герметизируют и отсоединяют контейнеры с эритроцитами, плазмой и ЛТС.

1.2.7. Контейнер с плазмой в соответствии с действующей НТД направляют на замораживание или приготовление препаратов плазмы.

1.2.8. Контейнер с ЛТС направляют на повторное центрифугирование с целью получения КТ и КЛ. ЛТС, выделенный из крови, хранившейся более суток, не используют.

1.2.9. К эритроцитам, оставшимся в основном контейнере (N 1), с помощью системы, составленной из полимерной иглы, соединенной с полимерной трубкой и введенной в штуцер контейнера N 1, резиновой трубки, соединенной с металлической иглой, введенной в пробку флакона с отмывающим раствором, прибавляют стерильный 0,9% раствор хлорида натрия, заполняя контейнер доверху и тщательно перемешивают. Трубку, ведущую к контейнеру, герметизируют завязыванием двух тугих углов или запаиванием. Контейнер помещают в центрифужный стакан, уравновешивают и центрифугируют при центробежном ускорении 2000 g в течение 5 минут при температуре 5 +/- 2 °C (см. таблицу режимов).

1.2.10. После центрифугирования контейнер осторожно переносят в бокс. Конец трубки обрабатывают 5% раствором йода и спиртом, отсекают герметизирующие узлы, трубку контейнера соединяют стерильно с системой флакона, освободившегося после отмывающего раствора и переводят в него с помощью плазмоэкстрактора надстой в виде физиологического раствора, остаток лейкоцитов и подлежащие эритроциты высотой около 0,5 см (10 мл), не нарушая принципа закрытого метода отмывания; присоединяют новый флакон 0,9% раствора хлорида натрия.

1.2.11. Процедуру отмывания повторяют еще 2 раза.

1.2.12. В ЭМОЛТ, полученной из крови, заготовленной в полимерные контейнеры и хранившейся не более 1 суток, концентрация лейкоцитов в 1 мл после 3-кратного отмывания составляет 2,6·10⁶ (удаление около 85% этих клеток); при использовании крови 2 - 7 суток хранения - не превышает 0,7·10⁶, что соответствует удалению более 90% лейкоцитов от их исходного содержания. Тромбоциты отсутствуют. Из 500 мл консервированной крови получают 130 - 150 мл ЭМОЛТ.

1.2.13. Этикетирование, хранение и контроль стерильности производят как указано в п.п. 1.1.9 - 1.1.11.

2.1.1. Эритроцитную массу хранят в холодильнике при температуре 4 +/- 2 °C.

2.1.2. Для заготовки ЭМОЛТ предпочтительно использовать ЭМ или эритроконцентрат, хранившиеся в течение 2 - 7 суток. Бутылки с эритроцитами переносят в бокс и обрабатывают, как указано в п. 1.1.4. Оставшийся после фракционирования крови на поверхности эритроцитов ЛТС удаляют с помощью вакуумного отсоса. Затем по стерильной системе в бутылку вводят стерильный физиологический раствор (заполняя бутылку доверху), тщательно перемешивают эритроциты. Пробку бутылки покрывают стерильной салфеткой, поверх - вощеной бумагой с фиксирующим ее резиновым кольцом и центрифугируют взвесь клеток в центрифуге при центробежном ускорении 2000 g в течение 5 минут при температуре 5 +/- 2 °C (см. таблицу режимов).

2.1.3. Удаление надстоя лейкоцитов с поверхности эритроцитов и подлежащих эритроцитов высотой 0,5 см производят как указано в п. 1.1.7.

2.1.4. Процедуру отмывания повторяют 2 раза.

2.1.5. На бутылку с эритроцитами, оставшимися после третьего отмывания, наклеивают этикетку с обозначениями, как указано в п. 1.1.10.

2.1.6. Контроль стерильности отмытия эритроцитов производят как указано в п. 1.1.11.

2.1.7. В ЭМОЛТ, полученной таким методом, количество эритроцитов составляет около 70 - 90 мл.

2.2.1. Предназначенные для заготовки ЭМОЛТ эритроцитную массу или эритроконцентрат, оставшиеся после фракционирования крови, заготовленной в полимерные контейнеры, хранят в холодильнике при 4 +/- 2 °C в течение 2 - 7 суток.

2.2.2. Для заготовки ЭМОЛТ контейнеры с эритроцитной массой или эритроконцентратом переносят в бокс.

2.2.3. Заготовку ЭМОЛТ производят как указано в п.п. 1.2.9 - 1.2.11.

2.2.4. На контейнер с ЭМОЛТ прикрепляют этикетку с обозначениями как в п. 1.1.10. Хранение и контроль стерильности ЭМОЛТ производят как указано в п. 1.1.11. Количество ЭМОЛТ составляет около 150 мл.

3.1.1. Предлагаемый метод получения ЭМОЛТ из консервированной крови 4 - 6 часов хранения основан на седиментации эритроцитов с помощью коллоидного осадителя желатина.

3.1.2. Кровь от донора заготавливают в полимерный контейнер "Гемакон" 500/300 в соответствии с "Инструкцией по применению полимерных контейнеров "Гемакон" и "Компопласт", М., 1983 г.

В момент заготовки крови необходимо тщательное перемешивание ее с гемоконсервантом.

3.1.3. В полимерный контейнер с консервированной кровью стерильно шприцем путей пункции дистального отдела донорской трубки вводят 40 мл стерильного 10% раствора медицинского желатина для внутривенного введения (ГФ Х, ст. 310), предварительно нагретого до +37 °C. Герметизируют трубку выше места пункции.

3.1.4. После тщательного перемешивания пластикатный контейнер с кровью помещают на крючок плазмоэкстрактора или штатива в вертикальном положении так, чтобы пустой контейнер находился ниже на столе.

3.1.5. По мере седиментации эритроцитов и образования слоя плазмы осторожным нажатием на стенки контейнера с кровью с помощью плазмоэкстрактора или вручную обеспечивают поступление отдельных порций лейкотромбоплазмы (ЛТП) в пустой пластикатный контейнер. Когда граница между эритроцитами и ЛТП оказывается у выходного отверстия основного контейнера, соединительную трубку перекрывают зажимом. Вся процедура повторяется до полного отделения надосадочной плазмы, содержащей лейкоциты и тромбоциты, и занимает в целом 30 - 40 минут.

3.1.6. Затем контейнер с ЛТП отделяют от контейнера с ЭМОЛТ. ЛТП используют для приготовления КТ и КЛ. Плазму направляют на замораживание (см. методические рекомендации "Заготовка концентратов лейкоцитов из консервированной крови с добавлением желатина" М., 1985 г.).

3.1.7. На контейнер с ЭМОЛТ прикрепляют этикетку с обозначениями как в п. 1.1.10, на которой дополнительно указывают на присутствие желатина в конечной концентрации 0,7%.

3.1.8. Полученная ЭМ лишена лейкоцитов и тромбоцитов на 80% от исходного уровня их в дозе крови.

3.1.9. Для большего удаления лейкоцитов, тромбоцитов, плазмы у желатина, необходимо дополнительно провести двухкратное отмывание ЭМОЛТ 0,9% раствором хлорида натрия. Отмывание осуществляют как указано в п.п. 1.2.9 - 1.2.10, используя режим центрифугирования 590 g в течение 15 минут при температуре 5 +/- 2 °C.

Возможно производить отмывание эритроцитов через сутки после выделения концентрата лейкоцитов.

3.1.10. В результате двухкратного отмывания в ЭМОЛТ объемом 130 - 150 мл (из дозы крови) достигается практически полное удаление плазмы и желатина, а лейкоцитов - на 93% от исходного содержания в крови; тромбоциты практически отсутствуют.

3.1.11. К контейнеру с ЭМОЛТ, полученной после второго отмывания прикрепляют этикетку, на которой указывают "ЭМОЛТ с использованием желатина и двухкратного отмывания". Остальные обозначения - как в п. 1.1.10.

Контроль стерильности ЭМОЛТ производят как в п. 1.1.11.

3.2.1. В полимерный контейнер "Гемакон" 500/300 или "Гемакон" 500/300/300, содержащий 100 мл гемоконсерванта, непосредственно перед эксфузией крови добавляют при помощи стерильного шприца путем пункции дистального отдела донорской трубки 40 мл стерильного раствора 10% медицинского желатина для внутривенного введения, предварительно нагретого до 37 °C.

3.2.2. Центрифугирование консервированной крови осуществляют при температуре 5 +/- 2 °C и режиме 1170 (см. таблицу режимов) в течение 12 минут. При этом основная масса лейкоцитов концентрируется в виде лейкоцитов в верхнем слое эритроцитной массы И пограничном слое плазмы.

3.2.3. Контейнер осторожно вынимают из центрифужного стакана и подвешивают на вертикальной пластине плазмоэкстрактора.

3.2.4. Путем сдавливания пластин плазмоэкстрактора переводят плазму в один из дополнительных контейнеров (при этом трубка второго контейнера должна быть пережата зажимом), оставляя слой плазмы над лейкопленкой высотой 0,5 см, после чего на соединительную трубку первого контейнера накладывают зажим.

3.2.5. Во второй дополнительный контейнер или в присоединенный контейнер "Компопласт" (после снятия зажима с соединительной трубки) последовательно переводят оставшийся слой плазмы, лейкопленку и подлежащий слой эритроцитов высотой 1 см, в которых сконцентрирована основная масса лейкоцитов, что в целом составляет объем до 100 мл. Соединяющую трубку контейнеров пережимают.

3.2.6. Все три контейнера герметизируют путем затягивания двух тугих узлов на соединительных треках или запаивания трубок с помощью заваривающих устройств, предназначенных для герметизации изделий из полимерных материалов. Контейнеры разъединяют.

3.2.7. Контейнер с КЛ этикетируют и используют для переливания.

3.2.8. Контейнер с плазмой используют как указано в п. 1.2.7.

3.2.9. Из оставшейся эритроцитной массы приготавливают взвесь отмытых эритроцитов, как указано в п.п. 1.2.9 - 1.2.10 и 3.1.9.

3.2.10. Эритроциты после двухкратного отмывания заливают в соотношении 1:1 0,9% раствором хлорида натрия, этикетируют как в п. 3.1.11 и п. 1.1.10 и хранят в холодильнике при 4 +/- 2 °C.

3.2.11. Контроль стерильности производят как указано в п. 1.1.11.

Заготовленная таким методом ЭМОЛТ содержит около 8% лейкоцитов и не более 3% тромбоцитов от их исходного содержания в цельной крови. Из 500 мл крови получают 130 - 150 мл ЭМОЛТ.

Перед трансфузией ЭМОЛТ врач обязан:

1. Проверить сохранность герметичности контейнера или бутылки с ЭМОЛТ.

2. Произвести макроскопическую (визуально) оценку качества ЭМОЛТ, обращая внимание на надстой, который должен быть прозрачным и бесцветным; допускается слабо-розовый цвет надстоя. Поверхность эритроцитов должна быть ровной.

3. Производить трансфузию ЭМОЛТ с учетом групповой и резус-принадлежности донора и реципиента в соответствии с "Инструкцией по технике переливания крови и ее компонентов", М., 1986 г.

Переливание ЭМОЛТ осуществляют не позднее 2-х часов после заготовки через системы для переливания крови и компонентов, выпускаемые промышленностью по ОСТ 64-2-166-83.

Считать утратившей силу "Инструкцию по приготовлению и применению отмытых эритроцитов", 1968 г.