Настоящий Сборник инструкций разработан в Государственном научно-техническом институте стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов имени Л.А.Тарасевича Министерства здравоохранения СССР.

Определение стерильности препаратов проводят с применением тиогликолевой среды, которая выпускается отечественной промышленностью в виде сухого препарата по утвержденной НТД.

Контроль отсутствия специфической микрофлоры, которая в силу особенностей технологии производства может контаминировать некоторые препараты, должен осуществляться в соответствии с методиками, изложенными в НТД на конкретные препараты.

"Входной" контроль каждой новой серии сухой тиогликолевой среды и контроль каждой партии среды, приготовленной из компонентов (включая случаи приготовления среды из сухого порошка, но с добавлением тиогликолевой кислоты или тиогликолята extempore), должен предусматривать оценку качества среды по стерильности, ростовым и нейтрализующим свойствам.

Контроль качества каждой их последующих партий тиогликолевой среды, приготовляемых из одной серии сухого препарата (прошедшей полный "входной" контроль), должен предусматривать оценку качества только по стерильности и ростовым свойствам.

Для проверки стерильности препаратов без ртутного консерванта (мертиолята) тиогликолевая среда может быть использована в течение двух недель со дня приготовления. Среду после приготовления следует хранить в защищенном от света месте при комнатной температуре.

Для проверки стерильности препаратов, содержащих мертиолят, готовая к употреблению тиогликолевая среда должна быть использована не позднее 1-3 суток со дня приготовления. Конкретные сроки годности (1, 2, 3 суток) каждой партии тиогликолевой среды устанавливают путем испытания ее нейтрализующих свойств через сутки, двое, трое - соответственно.

В случае использования сухой тиогликолевой среды срок годности для всех партий среды, приготовляемых из одной серии сухого препарата, устанавливают в процессе осуществления "входного" контроля.

Готовая к употреблению тиогликолевая среда должна отвечать следующим требованиям:

1.1. Стерильность - быть стерильной.

--------------------------------

<*> Методика разработана И.А.Гавристовой, З.М.Андреевой, Л.Г.Бендас

Для оценки стерильности готовой тиогликолевой среды после ее автоклавирования пробирки со средой в количестве не менее 2% от партии помещают в термостат при температуре 37 град. С. Учет результатов проводят через 48 часов путем визуального осмотра всех пробирок со средой. В случае пророста (помутнения) среды в оставленных на контроль пробирках, бракуют всю партию.

Образцы среды, выдержавшие двое суток при температуре 37 град. С, для проверки стерильности препаратов не используют.

Для определения данных свойств тиогликолевой среды используют следующие тест-штаммы:

аэроб - Alcaligenes faecalis 415 и

анаэроб - Clostridium novyi (oedematiens) 198.

Alcaligenes faecalis 415. Получен из института Листера (г.Лондон) в 1946 г. Подвижная грам-отрицательная палочка. Строгий аэроб. Непатогенен для человека и животных.

Clostridium novyi (oedematiens) 198. Выделен в 1930 г. Крупная грам-положительная спорообразующая палочка. Споры овальной формы, расположены субтерминально. Строгий анаэроб. Штамм непатогенен для морских свинок и мышей.

Тест-штаммы по требованию выдает ГИСК им. Л.А.Тарасевича с соответствующим паспортом. Замена указанных тест-штаммов другими не допускается.

Вскрывают ампулу с сухой культурой <*> Alcaligenes faecalis 415, стерильной пастеровской пипеткой добавляют (приблизительно 0,5 мл) бульон Хоттингера (приложение п. 2.), тщательно перемешивают до получения гомогенной суспензии и переносят в пробирки (по 1 шт) с бульоном Хоттингера и скошенным агаром Хоттингера (приложение п. 3.). Посевы инкубируют в течение 20-24 часов при 37 град. С.

--------------------------------

<*> после вскрытия ампулы проверяют основные свойства культуры, подтверждающие ее подлинность согласно паспорту.

Полученную с плотной среды <*> культуру пересевают на 2-3 косяка с той же средой (агар Хоттингера), далее инкубируют посевы в течение 20-24 часов при 37 град. С, после чего полученную культуру "уколом" пересевают на среду (8-10 пробирок) Романова (приложение п. 4.). Через 20-24 часа инкубации посевов при 37 град. С на ватные пробки пробирок, содержащих культуру, надевают резиновые колпачки и хранят при температуре (+4 град. С) - (+8 град. С) (не более 6 месяцев). Допускается, в случае необходимости (получение дополнительной партии пробирок с культурой, закладываемых на хранение), произвести пересев штамма Alcaligenes faecalis 415 со среды Романова на агар Хоттингера и вновь на среду Романова. Большее количество пассажей культуры не допускается.

--------------------------------

<*> В случае отсутствия роста культуры на плотной среде пересев на косяк с агаром Хоттингера производят из бульонной культуры.

Для получения рабочей культуры тест-штамм Alcaligenes faecalis 415 со среды Романова пересевают на 2-3 пробирки со скошенным агаром Хоттингера. Посевы инкубируют в течение 20-24 часов при 37 град. С, затем вторично пересевают на 2-3 пробирки с агаром Хоттингера и после выращивания в течение 18-24 часов при 37 град. С используют для оценки ростовых и нейтрализующих свойств тиогликолевой среды.

Вскрывают ампулу с сухой культурой <*>, стерильной пастеровской пипеткой добавляют (приблизительно 1 мл) предварительно регенерированную <**> среду Тароцци (приложение п. 5), тщательно перемешивают и полученную гомогенную суспензию переносят в две пробирки с той же средой (посевной материал вносят на дно пробирки). Посевы инкубируют в течение 48 часов при 37 град. С.

--------------------------------

<*> после вскрытия ампулы проверяют основные свойства культуры, подтверждающие ее подлинность согласно паспорту.

<**> во всех случаях при посеве культуры С novyi 198 на среду Тароцци пользуются регенерированной средой. Регенерацию среды осуществляют перед посевом путем выдерживания пробирок со средой в кипящей водяной бане в течение 10-15 мин. и последующего быстрого охлаждения в холодной воде.

Полученную культуру из обеих пробирок, соблюдая правила асептики, переносят во флакон емкостью 20-30 мл (кусочки мяса не должны попадать) и центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 20 минут. Далее, с помощью пипетки отсасывают надосадочную жидкость, в полученную биомассу добавляют небольшое количество разводящей жидкости (приложение п. 6), перемешивают и переносят <*> в пробирку для подведения под оптический стандарт мутности, соответствующий 10 единицам.

--------------------------------

<*> следует иметь в виду, что при работе с анаэробной

культурой перемешивание осуществляют с помощью пипетки, при этом во избежание попадания воздуха в культуру, пипетку не вынимают из жидкости.

После подведения под стандарт суспензию культуры по 1 мл высевают на 10-15 пробирок с 10 мл предварительно регенерированной питательной среды (приложение п. 7) (аналогично регенерации среды Тароцци) для получения споровой культуры. (Для определения чистоты культуры при всех пересевах рекомендуется производить высев на скошенный агар Хоттингера). Далее, посевы инкубируют в течение 48 часов при 37 град. С, после чего содержимое пробирок перемешивают с помощью стерильной пипетки, делают мазки полученной культуры (окрашивание производят 1% раствором генцианвиолета в течение 30 секунд), микроскопируют и определяют количество спор (М) в % по формуле:

где n - число спор в 3-5 полях зрения,

N - общее число (не менее 100) сосчитанных клеток (палочки и споры) в 3-х - 5-ти полях зрения.

На ватные пробки пробирок, содержащих культуру, в которой не менее 5% спор, надевают резиновые колпачки и хранят при температуре +4 град. С - +8 град. С.

В случае необходимости (частый контроль) иметь большее количество пробирок с культурой, закладываемых на хранение, полученную культуру в споровой форме следует пересеять на среду Тароцци (5-6 пробирок), инкубировать посевы при температуре 37 град. С в течение 48 часов и далее получить споры по описанной выше методике.

Для получения рабочей культуры Clostridium novyi 198 споровую культуру тест-штамма, хранящуюся на полужидкой среде, перемешивают с помощью пипетки и по 1 мл пересевают на 2-3 пробирки с 10 мл среды Тароцци. Содержимое одной пробирки со споровой формой Clostridium novyi 198 используют для 2-3-х посевов. Посевы инкубируют в течение 24-48 часов при 37 град. С до обнаружения отчетливо видимого роста культуры в виде диффузного помутнения среды с четко выраженной прозрачной зоной. После чего осуществляют второй пересев тест-штамма на 2-3 пробирки с той же средой, инкубируют в течение 17-19 часов при 37 град. С и используют для оценки ростовых свойств тиогликолевой среды.

Для ускорения контроля 24-48 часовую культуру Clostridium novyi 198, полученную после высева из ампулы, следует пересеять на 2-3 пробирки со средой Тароцци, инкубировать 17-19 часов при 37 град. С и полученную культуру использовать для посева непосредственно в тиогликолевую среду.

Рабочую культуру Alcaligenes faecalis 415, выращенную на агаре Хоттингера (2 пассаж), смывают с косяка стерильным физиологическим раствором и тщательно перемешивают с помощью стерильной пипетки. Затем некоторое количество полученной суспензии переносят в стерильную пробирку для подведения под оптический стандарт, соответствующий 10 единицам мутности.

--------------------------------

<*> Не допускается выдерживание культуры в разводящей жидкости более 30 минут.

Для определения данных свойств тиогликолевой среды используют тест-штамм Alcaligenes faecalis 415, характеристика, хранение и подготовка которого для посева в тиогликолевую среду описаны выше (п. 2.2).

Стерильный 0,85% раствор хлористого натрия предварительно разливают в три пробирки, в первую из которых вносят 8 мл физиологического раствора и 1 мл раствора мертиолята в концентрации 1:1000 <*>, а в две другие - по 9 мл физиологического раствора и 1 мл раствора мертиолята. Содержимое двух последних пробирок перемешивают с помощью стерильной пипетки и удаляют из них по 1 мл раствора с целью обеспечения в каждой пробирке объема раствора, равного 9 мл.

--------------------------------

<*> Раствор мертиолята в концентрации 1:1000 (0,1 г мертиолята на 100 мл стерильного физиологического раствора) готовят во флаконе из темного стекла и хранят не более 4-х месяцев при +4 град. С - +8 град. С.

По окончании соответствующих сроков инкубации посевов проводят визуальный просмотр засеянных пробирок. Результаты контроля регистрируют в специальном журнале (приложение п. 8) и дают ответ о качестве тиогликолевой среды.

Партия тиогликолевой среды, не прошедшая контроль по нейтрализующим свойствам и прошедшая по ростовым может быть использована для контроля стерильности препаратов, не содержащих ртутный консервант.

Контроль стерильности биологических препаратов, вакцин, сывороток, анатоксинов, аллергенов, иммуноглобулинов и т.д. проводят путем исследования образцов готового препарата в полуфабрикате и готовой серии препарата. Готовым препаратом в полуфабрикате считают препарат, находящийся в одной производственной емкости (или разлитый в бутылки из этой емкости), из которой производят розлив в ампулы или флаконы.

Примечание. Контроль полуфабриката на более ранних стадиях должен осуществляться в соответствии с технологическими регламентами.

Готовая серия препарата - это совокупность емкостей (ампул или флаконов), разлитых из одной производственной емкости, запаянных или герметизированных тем или другим способом, идентичных в отношении опасности загрязнения во время розлива или высушивания.

Примечание. Совокупность емкостей, высушенных в одной сушильной камере, контролируется как отдельная серия.

Образец для контроля - это количество препарата, необходимое для первичного посева на питательную среду по представленной ниже схеме (не менее 2 мл). В том случае, если емкости (ампулы или флаконы) содержат меньший объем препарата, то образец составляют из смеси содержимого нескольких емкостей.

Для контроля стерильности готового препарата в полуфабрикате берут выемку препарата в количестве не менее 6 мл. Предварительно содержимое бутылки или др. производственной емкости, в которой находится полуфабрикат, тщательно перемешивают. Взятая выемка полуфабриката должна быть посеяна в виде трех или более образцов (не менее 2 мл каждый) по схеме, представленной ниже (3.2.).

В процессе розлива препарата для контроля стерильности берут не менее, чем по одному образцу в начале, середине и в конце розлива. Для контроля могут быть взяты пробы, отобранные в процессе розлива в отдельные лабораторные емкости (пробирки, флаконы) или герметизированные емкости, в которые осуществляется розлив препарата.

При контроле стерильности готового (разлитого, высушенного) препарата количество контролируемых емкостей (ампул или флаконов) определяется с учетом общего количества емкостей в серии. Для определения минимального числа емкостей, необходимого для контроля стерильности, следует в соответствии с рекомендациями Всемирной Организации Здравоохранения произвести расчет по формуле:

где

n - необходимое для контроля число емкостей,

N - число емкостей в серии.

Принимая во внимание, что за образец для контроля принято количество препарата, необходимое для первичного посева на питательную среду (не менее 2 мл), число контролируемых емкостей и число засеваемых образцов может не совпадать. В случаях, когда объем препарата в каждой емкости равен или превышает 2 мл, число контролируемых емкостей и число засеваемых образцов будет одинаковым. При меньшем объеме розлива (менее 2 мл в емкости) число засеваемых образцов будет меньше, чем число контролируемых емкостей за счет объединения нескольких емкостей в один образец.

Для удобства расчетов предлагается таблица I, позволяющая определять число емкостей и образцов, необходимое для контроля, с учетом объема серии и объема препарата в каждой емкости.

Примечание 1. Число емкостей необходимое для контроля стерильности представляет собой суммарное число емкостей контролируемых на разных этапах - в производственном отделении и в ОБК.

Примечание 2. Если серия включает в себя менее 500 емкостей, количество контролируемых емкостей должно быть не менее 10.

Примечание 3. При необходимости, с учетом особенностей технологии изготовления отдельных видов препаратов и особенностей фасовки, в соответствующей технической документации могут быть регламентированы дополнительные требования в отношении необходимого количества контролируемых емкостей, обеспечивающие надежность контроля стерильности препаратов.

Примечание 4. При отбраковке разлитого препарата из-за несоответствия физических свойств требованиям ТУ (помутнение, появление хлопьев), отбракованные ампулы или флаконы должны быть переданы в ОБК для выяснения характера помутнения и при необходимости проведения контроля стерильности.

Количество емкостей, отправленное в ГИСК им. Л.А.Тарасевича, должно соответствовать общему количеству, контролируемому в производственном отделе и в ОБК с учетом величины серии и объема препарата, разлитого в ампулы или флаконы.

Лица, проводящие контроль стерильности, непосредственно перед работой в боксе моют руки с мылом при помощи щетки. В предбокснике обувь меняют на специальную боксовую, надевают стерильный халат, колпак или косынку и 4-х слойную марлевую повязку (маску), которая должна закрывать нос и рот. При работе в боксе движения, разговоры, перемещения должны быть максимально ограничены.

Перед внесением в бокс ампулы (флаконы) с препаратами должны быть проверены на герметичность путем тщательного просмотра, а препараты, высушенные под вакуумом, должны быть проверены на вакуум. После этого ампулы (флаконы) обрабатывают 3% раствором перекиси водорода.

Перед началом работы в боксе руки должны быть обработаны спиртом.

Перед вскрытием ампул или флаконов оттянутый конец ампулы или горлышко флакона протирают спиртом и обжигают в пламени горелки.

Исследуемый препарат набирают стерильной пастеровской пипеткой при помощи ножной или ручной груши. Перед посевом пипетка проводится через пламя горелки, но не прокаливается. Посев каждого образца препарата производят отдельной стерильной пипеткой в толщу питательной среды без выдувания. Использованные пипетки, ампулы и флаконы от препаратов помещают в 3% раствор перекиси водорода и оставляют на 24 часа, после чего производится их дальнейшая обработка.

Примечание 1. Запрещается прокаливать ампулы и пастеровские пипетки в пламени горелки.

Примечание 2. Запрещается производить посев пипеткой без груши (ртом).

Перед посевом жидких препаратов содержимое ампул или флаконов необходимо встряхивать (т.к. микробы - контаминанты могут осесть на дно).

Образцы сухих препаратов предварительно растворяют стерильным растворителем (изотонический раствор хлорида натрия, дистиллированная вода и т.д.) в объеме, предусмотренном соответствующей технической документацией и после растворения засевают на питательную среду. Стерильность используемого растворителя проверяют путем его посева (по одному мл) на две пробирки, содержащие по 20,0 мл тиогликолевой среды, пробирки выдерживают при температуре 35-37 град. С и 20-22 град. С соответственно в течение 14 суток одновременно с опытными пробирками. Посев растворителя для контроля стерильности производят до начала работы и после ее окончания. Если при посеве сухих препаратов используют несколько флаконов растворителя, стерильность каждого флакона должна быть проверена аналогичным способом.

Контролируемый на стерильность образец засевают пастеровской пипеткой приблизительно по 1 мл на две пробирки, содержащие по 20,0 мл тиогликолевой среды, одну из которых инкубируют при температуре +35-37 град. С для выявления аэробных и анаэробных микроорганизмов, а другую - при температуре +20-22 град. С для выявления грибов.

Для препаратов, не вызывающих помутнения питательной среды (иммуноглобулины, инфекционные и неинфекционные аллергены, различные сыворотки и растворители и т.п.) пробирки выдерживают в течение 14 суток при указанных выше температурах.

Для препаратов, вызывающих помутнение питательной среды (препараты, содержащие сорбенты, микробную массу, мозговую ткань и т.п.) посев производят по указанной выше схеме, но через 5-7 суток из каждой пробирки производят пересев приблизительно по 0,5 мл на две пробирки, содержащие по 10,0 мл тиогликолевой среды, выдерживают после пересева при 35-37 град. С и 20-22 град. С соответственно. Эти пробирки инкубируют в течение 7-9 суток, в зависимости от срока пересева с таким расчетом, чтобы общий период инкубации первичного посева и пересева составлял 14 суток.

Примечание 1. Пробирки, из которых произведен пересев, сохраняются до окончания контроля стерильности.

Примечание 2. При необходимости, с учетом особенностей технологии изготовления отдельных видов препаратов, в соответствующей технической документации могут быть регламентированы дополнительные, экспериментально обоснованные требования в отношении срока и режима инкубации.

Окончательный учет результатов контроля стерильности производят путем макроскопического, а в случаях пророста и микроскопического исследования всех посевов через 14 суток после первичного посева на тиогликолевую среду.

Серия считается стерильной, если ни в одной из засеянных пробирок не наблюдается роста.

В случаях роста хотя бы в одной из засеянных пробирок контроль стерильности повторяют на том же количестве образцов, проверяя каждый образец в соответствии с представленной выше схемой. В случае роста должна быть проведена микроскопия выросших микробов. Мазки должны быть окрашены по Граму. В документации отмечают температуру, при которой произошел пророст, морфологию и окраску микробов по Граму. При отсутствии роста при повторном контроле препарат считают стерильным. При наличии роста при повторном контроле хотя бы в одной пробирке и идентичности микрофлоры при первичном и повторном посевах препарат бракуют, как нестерильный. Если при первичном и повторном посевах выявлена различная микрофлора, а также и в том и в другом случае отмечался пророст лишь в отдельных пробирках, в порядке исключения, допускается посев образцов в третий раз. При отсутствии роста препарат признают стерильным. Если в этом случае обнаруживают рост хотя бы в одной пробирке, независимо от характера микрофлоры, препарат признают нестерильным и бракуют.

Результаты контроля исследуемых препаратов регистрируют в специальных производственных журналах.

Контроль стерильности медицинских биологических препаратов должен проводиться квалифицированным персоналом в специальных боксах с обеспечением строгих правил асептики.

Боксы представляют собой изолированные застекленные камеры достаточной площади и кубатуры для проведения в них бактериологических исследований. Боксы должны быть хорошо освещены и обеспечены вентиляцией. Оптимальным является оборудование боксов приточно-вытяжной вентиляцией с подачей стерильного кондиционированного воздуха.

Внутреннее устройство боксов должно обеспечивать легкость и надежность поддержания чистоты и возможность дезинфекционной обработки. С этой целью газовые и водопроводные трубы, а также электропроводку размещают вне бокса или в толще его стен. Отопительные батареи устанавливают гладкими без ребер, что препятствует осаждению пыли. Стены бокса на высоту не менее полутора метров от пола облицовывают метлахской плиткой, или как и потолок, окрашивают в светлые тона масляной краской. Полы покрывают линолеумом, метлахской плиткой или пластиком. Такая отделка поверхностей позволяет использовать при уборке помещения дезинфицирующие растворы. В боксе должно находиться минимальное количество мебели - стол и табуреты.

За последние годы хорошо зарекомендовали себя в работе настольные боксы с ломинарным потоком стерильного воздуха, позволяющие проводить исследования в условиях, исключающих возможность загрязнения испытуемого препарата.

Примечание: В боксах, предназначенных для проведения контроля стерильности медицинских биологических препаратов, работа с живыми микробными культурами не допускается.

К боксу должен примыкать предбоксник, отделенный от него стеклянной перегородкой с дверью и передаточными окнами - помещение, куда вносятся подготовленные для посева препараты, питательные среды, пипетки и биксы со стерильными халатами, косынками или колпаками, марлевыми повязками (масками). В предбокснике персонал переодевается в стерильную одежду и специальную обувь для боксов.

Перед входом в бокс и предбоксник помещают матерчатый или губчатый коврик, увлажненный 3% раствором перекиси водорода, для протирания обуви.

К предбокснику должна примыкать комната, где хранятся питательные среды, необходимые для проведения контроля стерильности стерильная посуда; в этой комнате проводят всю вспомогательную работу (обработка 3% раствором перекиси водорода образцов ампул и флаконов с препаратами, штативов для питательных сред, маркировка пробирок и т.д.).

Ежедневно бокс и предбоксник подвергают тщательной уборке и обеззараживают путем протирания ветошью, смоченной в 3% растворе перекиси водорода с 0,5% сульфанола или порошка "Новость". Для приготовления раствора перекиси водорода с моющими средствами используют любую посуду, в которой разводят пергидроль водой (добавляют в воду пергидроль, а затем моющие средства).

Для приготовления 10 л раствора берут следующие количества препаратов: 1200 мл пергидроля, 50 г моющего средства и 8750 мл воды при 40-50 град.

Примечание: Для простоты приготовления раствора целесообразно иметь вымеренную по объему посуду, соответствующую весу или объему ингредиентов, из которых готовят рабочий раствор.

Готовят раствор и обрабатывают бокс и предбоксник в резиновых перчатках и марлевой повязке (маске). Норма расхода дезинфицирующего раствора 70-100 мл/кв. м.

Раствор готовят непосредственно перед употреблением. При отсутствии возможности использовать дезинфицирующий раствор, производят обработку горячим (50-60 град.) мыльно-содовым раствором (1% раствора соды или стирального порошка и 0,5% нашатырного спирта) с последующим протиранием стен, полов, мебели одним из следующих дезинфицирующих растворов:

а. 2% раствор хлорамина,

б. 3% раствор фенола,

в. раствор антисептола.

Для приготовления антисептола берут 2 раствора: 50% раствор хлорной извести и 5% раствор кальцинированной соды. Перед употреблением растворы сливают в равных объемах и разбавляют в 50 раз водой. Работу с антисептолом производят в резиновых перчатках.

Для обеззараживания боксов применяют бактерицидные лампы БУВ, устанавливаемые из расчета: 1 лампа БУВ-30 на 12 куб. метров объема воздуха или 2-2,5 ватта мощности на квадратный метр поверхности (числа в названиях ламп обозначают их мощность в ваттах). Лампы размещают на потолке и на стенах. Облучение бокса производят до начала работы в течение 1,5-2 часов. Во время работы лампы должны быть выключены. Необходимо учитывать время эксплуатации ламп и по окончании гарантийного срока заменять лампы новыми, если даже они продолжают "светить".

Ежедневно в начале работы и в конце работы контролируют чистоту воздуха в боксе и предбокснике, помещая на 15 минут открытые чашки Петри с питательным агаром и со средой Сабуро, с последующим термостатированием первых при температуре 35-37 град. С в течение двух суток, а во вторых при 20-22 град. С в течение трех суток.

Допустимым считается рост не более 5 колоний микробов - сапрофитов на одной чашке. Рост большего числа колоний указывает на повышенную загрязненность воздуха в боксе. В этих случаях необходимо провести дополнительную дезинфицирующую обработку бокса и предбоксника. В случае появления колоний грибов помимо дезинфекции обращают особое внимание на снижение влажности в боксе и предбокснике путем просушивания с помощью электронагревательных приборов. Если в боксе выявляются спорообразующие микроорганизмы или грибы, то при уборке помещения увеличивают концентрацию перекиси водорода до 6%.

У лиц, работающих в боксе, периодически проверяют степень обсемененности рук после мытья. Эту проверку проводят следующим образом: пальцами рук прикасаются к поверхности плотной питательной среды в чашке Петри и делают несколько круговых движений, "засеянные" чашки термостатируют при 35-37 град. в течение двух суток. Появление более 5 колоний сапрофитов указывает на недостаточную чистоту рук для проведения асептической работы.

Результаты проверки обсемененности воздуха бокса и предбоксника и обсемененности рук должны быть зарегистрированы в специальных журналах.

Постоянно следует обращать особое внимание на надежность стерилизации используемых для работы в боксе инструментов, лабораторной посуды, дистиллированной воды и различных растворов. Должен быть обеспечен надежный контроль указанных материалов, а также тщательный контроль стерильности используемых питательных сред.

Утратил силу. - Приказ Минздрава СССР от 08.04.1991 N 99.

Испытание проводят на здоровых кроликах обоего пола весом 1,5-2,5 кг, содержащихся на полноценном рационе. Кроликов отбирают за 5 дней до опыта. Каждого кролика содержат в отдельной клетке в помещении с постоянной температурой (допустимые отклонения +/- 3 град.С). При уборке клеток и взвешивании животных их оберегают от возбуждения (избегать шума, стука, резких движений).

Взвешивание кроликов производят через день до дачи корма, всего не менее 3 раз. В течение срока, предшествующего опыту, кролики не должны терять в весе. Животные, теряющие в весе, к опыту не пригодны. В течение 3 суток перед испытанием у каждого подопытного кролика измеряют температуру. Измерения производят ежедневно утром, до дачи корма, при помощи медицинского термометра или электротермометра, точность которого не должна уступать точности медицинского термометра. Температурные щупальцы электротермометра или ртутные термометры вводят ректально за внутренний сфинктр на глубину около 5 см на время, необходимое для достижения максимальной температуры, но не менее чем на 5 минут. Измерение температуры следует проводить не ранее чем через 1 час после фиксирования кроликов. Исходная температура подопытных кроликов должна быть в пределах 38,5 град. - 39,5 град. С. Животные с более высокой или более низкой температурой для опыта непригодны.

За 24 часа до опыта кроликов переводят в помещение, в котором производят испытание на апирогенность. Определение должно проводиться в отдельной комнате с постоянной температурой 18-22 град. С, изолированной от шума, в спокойной обстановке. Вечером, накануне опыта у животных отбирают остаток корма. До опыта и во время опыта животные корма не получают (воду до опыта дают без ограничения). Испытуемый препарат проверяют на 3 кроликах. Перед инъекцией испытуемого раствора температура кроликов измеряется не менее 2 раз с промежутками в 30 минут. Разница между результатами обоих измерений не должна превышать 0,2 град. С. Средняя величина обоих измерений считается нормальной температурой и берется в основу определения повышения температуры.

Стерильный испытуемый препарат медленно вводят кроликам в ушную вену стерильным шприцом и иглой. Для каждого кролика берут отдельную иглу. Препарат вводят подогретым до 37 град. С не более чем через 30 минут после измерения исходной температуры. После введения препарата температуру измеряют 3 раза с промежутками 1 час.

Объем вводимого препарата и критерии оценки результатов испытания должны быть указаны в фармакопейных статьях на каждый испытуемый препарат.

Кролики, бывшие в опыте, могут быть использованы для определения пирогенности повторно (но не более 3-х раз) с интервалами 2-3 дня, если ранее введенный им препарат был апирогенным. Если введенный в первый раз препарат оказался пирогенным, кролики не могут быть использованы повторно.

Методические принципы исследования составлены на основании требований Всемирной Организации Здравоохранения, национальных требований ряда стран, а также существующей отечественной нормативно-технической документации.

1. Контроль живых вирусных вакцин

1.1. Контроль производственной клеточной культуры

1.1.а. Контроль в клеточных культурах

1. В гомологичной клеточной культуре другой партии

2. В культуре клеток человека

3. В культуре клеток, наиболее чувствительной к вирусам животного - продуцента производственной культуры.

1.1.б. Контроль на отсутствие микоплазм

1.2. Контроль объединенного вирусного сбора

1.2.а. Контроль в клеточных культурах

1. В гомологичной клеточной культуре другой партии.

2. В культуре клеток человека

3. В культуре клеток, наиболее чувствительной к вирусам животного - продуцента производственной культуры.

1.2.б. Контроль на животных.

1. На взрослых мышах.

2. На новорожденных мышах.

3. На морских свинках.

1.2.в. Контроль на куриных эмбрионах.

1. Введение материала в аллантоисную полость.

2. Введение материала в желточный мешок.

3. Введение материала на хориоаллантоисную оболочку.

1.2.г. Контроль на отсутствие микоплазм (контролю, помимо

объединенного вирусного сбора, подлежит готовый препарат)

1.2.д. Контроль на микобактерии туберкулеза.

2. Контроль инактивированных вирусных вакцин

В случаях производства инактивированных вирусных вакцин контролю подлежат:

1. Объединенный вирусный сбор, полученный при приготовлении вакцинного штамма.

2. Объединенный вирусный сбор, полученный при приготовлении посевного вируса.

3. Каждая партия производственной клеточной культуры.

Контроль осуществляется согласно методам, описанным для живых вирусных вакцин.

1. Контроль производственной клеточной культуры

Не менее 500 мл клеточной суспензии в концентрации, используемой при засеве производственных клеточных культур, предназначается для приготовления контрольных клеточных культур. Указанную часть клеточной суспензии разливают в матрасы, удобные для выполнения контрольных исследований.

Контрольные культуры инкубируют при тех же условиях, что и производственные, в течение 14 суток с момента внесения вируса в производственные культуры или до момента последнего слива вируссодержащей жидкости из производственных культур, если такой слив осуществляется позже, и просматривают под микроскопом на наличие цитопатических изменений. Учет результатов контроля может быть произведен в том случае, если за период наблюдения по неспецифическим причинам и вследствие различных случайностей будут отбракованы не более 20% контрольных клеточных культур.

По истечении срока наблюдения половину контрольных клеточных культур проверяют на наличие феномена гемадсорбции с эритроцитами морской свинки. При этом сливают культуральную жидкость, клеточный монослой отмывают раствором Хенкса или 0,85% раствором хлористого натрия, имеющим температуру 20 град. - 25 град. С, и в матрасы с культурой вносят 0,25% взвесь эритроцитов морской свинки в 0,85% растворе хлористого натрия в объеме, достаточном для того, чтобы покрыть весь клеточный монослой. После инкубации в течение 30 минут при температуре 0-4 град. С и последующей инкубации в течение 30 мин. при температуре 20 град. - 25 град. С взвесь эритроцитов сливают, клеточный монослой трижды отмывают раствором Хенкса или 0,85% раствором хлорида натрия, имеющим температуру 20 град. - 25 град. С, и просматривают под микроскопом на наличие гемадсорбции.

Кроме того, по истечении срока наблюдения из всех матрасов с контрольными культурами отбирают пробы культуральной жидкости (если на протяжении срока инкубации контрольных культур производят сливы вируссодержащей жидкости из производственных культур, то в те же сроки берут пробы культуральной жидкости из матрасов с контрольными культурами и сохраняют их в замороженном состоянии). Все пробы культуральной жидкости объединяют (сливая равные объемы) и вводят из расчета 1 часть контролируемой смеси проб (не менее 10 мл на каждую клеточную культуру) на 4 части питательной среды в три различные клеточные культуры - в гомологичную культуру другой партии, в культуру клеток человека и в клеточную культуру, вид которой зависит от субстрата производства вакцины. От каждой клеточной культуры оставляют по одному контрольному незараженному матрасу. Все культуры инкубируют при 36 град. - 37 град. С в течение 14 сут. с однократной сменой среды через 4-6 сут. после инокуляции и просматривают под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По окончании срока наблюдения культуры проверяют на наличие феномена гемадсорбции с эритроцитами морской свинки, как указано выше. Пробы считают прошедшими контроль, если в опытных и контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция. При наличии цитопатических изменений и (или) гемадсорбции в контрольных матрасах опыт следует повторить в клеточной культуре другой партии.

б) Контроль на отсутствие микоплазм.

Культуральную жидкость из контрольных матрасов, взятую по истечении срока наблюдения, проверяют на отсутствие микоплазм по методике, описанной в разделе контроля вируссодержащего материала.

2. Контроль вируссодержащего материала

Контролю подлежит объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакционного штамма, посевного вируса и вакцины. Если контроль осуществляется не позднее, чем через 24 часа после отбора проб вируссодержащей жидкости, то последние до проведения контроля хранятся при 4 град. С. При проведении контроля в более поздние сроки пробы замораживают и хранят при температуре, не превышающей -20 град. С. Оттаивание материала разрешается производить не более 1 раза.

а) Контроль в клеточных культурах

Для проведения контроля испытуемый материал (не менее 25 мл на каждую клеточную культуру) смешивают с иммунной сывороткой, взятой в количестве, достаточном для полной нейтрализации содержащегося в пробе вируса. Для получения иммунных сывороток используют животных, ткани которых не применяют для приготовления клеточных культур. Антиген для иммунизации животных готовят в клеточных культурах, не используемых при проведении контролей. Промежуток времени между извлечением испытуемого образца из холодильника (в случае хранения его при 4 град. С) или его размораживанием и добавлением иммунной сыворотки не должен превышать 30 мин.

Смесь инкубируют при заданной температуре в течение необходимого для нейтрализации данного вируса времени, после чего вносят в матрасы с тремя указанными выше видами культур клеток. В каждую клеточную культуру должно быть внесено не менее 25 мл испытуемого материала, и разведение его поддерживающей средой не должно превышать 1:4. Для каждого вида культуры клеток оставляют один контрольный незараженный матрас.

Культуры инкубируют при температуре 36 град. - 37 град. С в течение 14 сут. со сменой среды на 4-6 сут., просматривая под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По истечении 14 сут. опытные и контрольные клеточные культуры замораживают, оттаивают и производят пассаж на одноименной культуре, внеся в нее не менее 25 мл неосветленной культуральной жидкости. Разведение вносимого материала поддерживающей средой не должно превышать 1:4. В случае, если контроль производится в перевиваемой клеточной линии, по истечении указанного срока инкубации делается субпассаж.

Культуры (опытную и контрольную) инкубируют при 36 град. - 37 град. С в течение 14 сут. со сменой среды на 4-6 сут., просматривая под микроскопом на наличие цитопатических изменений. По истечении срока наблюдения культуры проверяют в реакции гемадсорбции, как указано выше. Материал считается прошедшим контроль, если и в опытных, и в контрольных культурах отсутствуют цитопатические изменения и гемадсорбция. При наличии цитопатических изменений и (или) гемадсорбции в контрольных культурах опыт повторяют на другой партии клеточной культуры.

б) Контроль на животных

Используются здоровые животные, не бравшиеся в опыт ранее. В случае, если содержащийся в контролируемом материале вирус патогенен для используемых при контроле животных, его необходимо предварительно нейтрализовать иммунной сывороткой или гамма-глобулином.

1. Контроль на взрослых мышах

Используют не менее 20 мышей массой 15-20 г. Каждому животному вводят по 0,03 мл испытуемого материала интроцеребрально и по 0,5 мл - интраперитонеально. Животных наблюдают 28 дней. Все мыши, которые погибают после первых 24 часов после введения материала, или у которых наблюдают признаки заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие признаков вирусной инфекции. Из соответствующих органов готовят 10% суспензию на 0,85 % растворе хлорида натрия и вводят ее не менее чем 5 мышам интрацеребрально и интраперитонеально. Животных наблюдают 21 день. Материал считается прошедшим контроль, если на протяжении периода наблюдению остаются здоровыми не менее 80% инокулированных животных и ни у одного из них не наблюдается признаков вирусного заболевания.

2. Контроль на новорожденных мышах

Используют не менее 20 новорожденных мышей не старше 24 час. Каждому животному вводят по 0,01 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 0,1 мл - интраперитонеально. Животных наблюдают 14 дней. Все мыши, которые погибают после первых 24 часов после введения материала, или у которых наблюдают признаки заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие признаков вирусной инфекции. Из соответствующих органов готовят 10% суспензию на 0,85% растворе хлорида натрия и вводят ее не менее чем 5 новорожденным мышам интрацеребрально и интраперитонеально. Животных наблюдают 14 дней. Материал считается прошедшим контроль, если на протяжении периода наблюдения остаются здоровыми не менее 80% инокулированных животных и ни у одного из них не наблюдается признаков вирусного заболевания.

3. Контроль на морских свинках

Используют не менее 5 морских свинок массой 300-350 г. Каждому животному вводят по 0,1 мл испытуемого материала интрацеребрально и по 5,0 мл - интраперитонеально. Животных наблюдают 42 дня. Все животные, которые погибают после первых 24 часов после введения материала, или у которых наблюдаются признаки заболевания, должны быть вскрыты и исследованы макроскопически на наличие признаков вирусной или туберкулезной инфекции. Органы их (селезенка, легкое, печень, сальник) и лимфоузлы (паховые, подмышечные, забрюшинные, трахеобронхиальные, портальные) должны быть исследованы микроскопически, а 10% суспензия (на 0,85% растворе хлорида натрия) этих органов и лимфоузлов исследуется культурально путем посева на яичную среду. В конце периода наблюдения все выжившие животные вскрываются и исследуются макроскопически на наличие признаков вирусной или туберкулезной инфекции. Материал считается прошедшим контроль, если не менее 80% инокулированных животных остаются здоровыми к концу периода наблюдения, и не у одного из них не наблюдается признаков вирусной или туберкулезной инфекции.

в) Контроль на куриных эмбрионах

В случае, если содержащийся в контролируемом материале вирус патогенен для куриных эмбрионов, его необходимо предварительно нейтрализовать иммунной сывороткой или гамма-глобулином. Материал вводят трем партиям куриных эмбрионов.

10 куриным эмбрионам 9-10 дневного возраста материал вводят по 0,25 мл в аллантоисную полость. Эмбрионы инкубируют при 37 град. С в течение 5-6 суток. По истечении указанного срока аллантоисную жидкость проверяют в реакции гемагглютинации с эритроцитами морской свинки и петуха. При этом в лунках агглютнационных досок готовят 5-6 последовательных двукратных разведений (на 0,85% растворе хлорида натрия) аллантоисной жидкости из каждого инокулированного эмбриона. Затем в лунки добавляют равные объемы 0,5% суспензии (на 0,85% растворе хлорида натрия) эритроцитов. После 30-40 мин. инкубации при 20 град. - 25 град. С учитывают результаты. Материал считается прошедшим контроль, если в течение указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов и реакция гемагглютинации во всех случаях отрицательна. 10 куриным эмбрионам 7-8 дневного возраста материал вводят по 0,25 мл в желточный мешок. Эмбрионы инкубируют при 37 град. С в течение 10 сут. Материал считается прошедшим контроль, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов.

10 куриным эмбрионам 10 дневного возраста материал вводят по 0,2 мл на хорионаллантоисную оболочку с боковой поверхности яйца через искусственную воздушную полость или со стороны естественного воздушного мешка. Эмбрионы инкубируют при 37 град. С в течение 5-6 суток. По истечении указанного срока извлекают и просматривают оболочки. Материал считается прошедшим контроль, если к концу указанного срока инкубации остаются живыми не менее 80% инокулированных эмбрионов и на хорионаллантоисных оболочках отсутствуют макроскопические изменения.

г) Контроль на отсутствие микоплазм

Контролю подлежат: объединенный вирусный сбор, полученный в процессе приготовления вакционного штамма, посевного вируса и вакцины, а также готовые формы указанных препаратов.

Применяют питательную среду следующего состава:

Приготовление 1 л среды:

К гидролизату бычьего сердца в количестве 200 мл (с содержанием сухих веществ 8-10%) добавляют 400 мл мясного экстракта 1:2 с содержанием сухих веществ 3,0-3,5% и экстракт дрожжей из расчета 1,5 г сухих веществ на 1 л среды, а также 5,0 г хлористого натрия и 3,0 г агара. С помощью 10% раствора NaOH устанавливают значение рН, равное 8,0. Среду кипятят 2-3 мин. до расплавления агара, фильтруют при необходимости, разливают и стерилизуют при 0,5 ати в течение 30 минут.

Перед употреблением среду разогревают в водяной бане до полного расплавления агара, охлаждают до 40-45 град. С, добавляют 15% сыворотки лошади или теленка (без консерванта) и 100 ед/мл пенициллина и разливают по 10 мл в пробирки. У каждой серии среды проверяют чувствительность к микоплазмам, используя стандартный штамм микоплазм. Подлежащий контролю материал вносят по 0,5 мл в каждую из 10 пробирок со средой. Посев производят столбиком от дна пробирки. Пробирки инкубируют в течение 14 сут. при 87 град. С. Просмотр пробирок проводят на 3, 5, 7 и 14 сутки. При наличии роста микоплазм хотя бы в одной пробирки материал бракуют.

д) Контроль на микобактерии туберкулеза.

Исследуемый материал засевают по 0,5 мл в 10 пробирок со средой Левинштейна. Посевы инкубируют при 38 град. С в течение 30 сут. При наличии роста микобактерий туберкулеза хотя бы в одной пробирке материал бракуют.

Примечания:

1. Данные методические указания распространяются на вирусные вакцины, продуцентами клеток для приготовления которых являются животные, получаемые из неконтролируемых хозяйств. При получении животных из закрытых, контролируемых хозяйств схема контроля меняется в соответствии с требованиями ВОЗ.

2. В частных фармакопейных статьях на отдельные препараты, учитывая специфические особенности их производства, возможно введение дополнительных методов контроля.

3. За исключением случаев, указанных в тексте методики, проведение повторного контроля запрещается.

Испытания на токсичность с применением нижеописанных методов должны проходить серии препаратов, предназначенных для внутривенного, внутримышечного, подкожного и внутрикожного введения. Испытания токсичности препаратов, вводимых человеку иными способами, может быть проведено, как методами, описанными в настоящем разделе, так и методами, сформулированными в частной фармакопейной статье.

Испытания проводят на двух видах животных: белых мышах массой 17-20 г и морских свинках массой 250-350 г (частной фармакопейной статьей может быть предусмотрено использование животных меньшей массы).

В исследованиях должны быть использованы здоровые животные, содержащиеся на регламентированном пищевом рационе, которые ранее не использовались для проведения каких-либо испытаний. Исходную массу животных определяют и регистрируют в день начала испытания.

Белые мыши. Препарат вводят внутрибрюшинно 5 животным в дозе, равной одной максимальной разовой дозе для человека, но не более 1 мл. Сухой препарат растворяют прилагаемым растворителем в соответствии с указанием на этикетке. Если препарат вводят человеку внутривенно, то его токсичность для белых мышей также определяют при внутривенном введении. Препарат должен вводиться в дозе, не превышающей 0,5 мл, со скоростью 0,1 мл/сек.

Морские свинки. Препарат вводят подкожно 2 животным в дозе, равной одной максимальной разовой дозе для человека, но не более 10 мл. Сухой препарат растворяют прилагаемым растворителем в соответствии с указанием на этикетке. Если препарат вводят человеку внутривенно, то его токсичность для морских свинок определяют при внутрибрюшинном введении, в этом случае доза препарата должна быть равна одной максимальной разовой дозе для человека, но не превышать 5 мл.

Наблюдение за животными осуществляют ежедневно в течение 7 дней с регистрацией всех изменений в состоянии здоровья каждого животного. В день окончания наблюдения каждое животное взвешивают.

Испытание считают удовлетворительным, если:

- все животные остаются живыми в течение периода наблюдения;

- ни у одного из животных не выявлены признаки заболевания;

- масса каждого животного в день окончания наблюдения не уменьшилась по сравнению с исходным.

Помимо этого, ни у одной морской свинки, получившей препарат подкожно, в месте введения не должен развиваться некроз или абсцесс (возможность развития других симптомов местной реакции и их допустимые размеры определяют в частной фармакопейной статье).

Если в течение периода наблюдения регистрируются гибель, заболевание, уменьшение массы, развитие некроза или абсцесса хотя бы у одного животного, испытание должно быть повторено на удвоенном количестве животных того же вида. Повторное испытание считают удовлетворительным, если препарат отвечает вышеперечисленным требованиям.

В случае, когда в частной фармакопейной статье предусмотрено испытание специфической безвредности готового препарата, которое включает требования, предъявляемые к испытанию на токсичность, то испытание на токсичность на соответствующем виде животных может не проводиться.

Введение дополнительных методов испытания на токсичность в частную фармакопейную статью не исключается.