Настоящая фармакопейная статья распространяется на вакцину оспенную эмбриональную живую, таблетки жевательные для орального применения. Вакцина представляет собой вирус вакцины, выращенный в хорионаллантоисной оболочке (ХАО) и плодике куриного эмбриона (КЭ), и высушенный со стабилизатором без консерванта. В таблетке содержится вируссодержащий материал и вспомогательные вещества, разрешенные к медицинскому применению.

Вакцина оспенная эмбриональная живая предназначена для профилактики натуральной оспы и заболеваний, вызываемых вирусами оспы животных, патогенными для человека.

Все этапы производства вакцины должны осуществляться с соблюдением установленных требований к правилам организации производства и контролю качества лекарственного препарата, гарантирующих его качество и безопасность для человека.

Производство вакцины оспенной эмбриональной живой должно проводиться в отдельных изолированных помещениях, в которых не допускается производство других лекарственных средств. Условия производства должны соответствовать требованиям Санитарных правил "Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней".

Основные этапы производства:

- получение вируссодержащего материала путем введения посевного вируса на ХАО КЭ;

- инкубирование инфицированных эмбрионов, извлечение плодика и ХАО из эмбриона;

- гомогенизация материала;

- приготовление жидкой вакцины и добавление стабилизатора;

- лиофильная сушка материала;

- подготовка и расчет вспомогательных веществ для получения таблеток;

- прессование таблеток.

Характеристика материалов животного происхождения, используемых в производстве. В качестве продуцента для производства вакцины и посевного материала используют 12-суточные куриные эмбрионы пород "Леггорн", "Роменбраун", "Родонит", "Изобраун", "Русская белая", кросс 46, линия П4, П6. Яйца куриные инкубационные получают из птицехозяйств, свободных от вирусных и других заболеваний, патогенных для человека.

Требования к производственному штамму. Для производства вакцины оспенной эмбриональной живой используют штамм вируса осповакцины БИЭМГ (Б-51). Для приготовления вакцины используется посевной вирус первых 10 пассажей.

Штамм должен отвечать следующим требованиям:

- формировать на ХАО КЭ два вида (специфических образований) оспин: не менее 80% белых плотных оспин размером 1-5 мм ("белый" клон) и не более 20% сероватых расплывчатых поверхностных оспин размером 1-3 мм ("серый" клон);

- при культивировании на ХАО КЭ при температуре () °С в течение (42-48) ч вирус вакцины должен накапливаться в концентрации 10⁸ ООЕ/мл (ООЕ - оспообразующие единицы);

- не вызывать некроз кожи кроликов при внутрикожном введении в дозе 10⁴ ООЕ в 0,1 мл;

- не вызывать гибели кроликов при внутримозговом введении в дозе 10⁶ ООЕ в 0,1 мл;

- быть безвредным (нетоксичным) для морских свинок и белых мышей в дозах соответственно 3 · 10⁷ и 1,2 · 10⁶ ООЕ/мл при подкожном введении.

Допустимое количество микроорганизмов в пересчете на 1 мл:

- общее число аэробных бактерий - не более 10³;

- общее число грибов - не более 10²;

- должны отсутствовать Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Производственный штамм контролируется на каждом пассажном уровне.

Описание. Таблетки жевательные круглые двояковыпуклые с риской и цельными краями диаметром 8-13 мм светло-коричневого цвета с запахом ванили. Определение проводят органолептически. По внешнему виду таблетки должны соответствовать требованиям ОФС "Таблетки".

Подлинность. Вакцина должна вызывать на хорионаллантоисных оболочках 12-суточных КЭ характерные специфические образования (оспины) 2 видов: не менее 80% белых плотных оспин размером 1-5 мм ("белый" клон), не более 20% расплывчатых сероватых поверхностных оспин размером 1-3 мм ("серый" клон). Контроль проводят одновременно с определением специфической активности (раздел "Специфическая активность").

Средняя масса и отклонение от средней массы. От 0,2 до 1 г. Определение проводят в соответствии с ОФС "Таблетки".

Распадаемость. Должны распадаться в течение 1 ч. Определение проводят в соответствии с ОФС "Распадаемость таблеток и капсул".

Потеря в массе при высушивании. Не более 3,0%. На 2 параллельных анализа используют не менее 7 таблеток. Определение проводят по ОФС "Потеря в массе при высушивании".

Микробиологическая чистота. Допустимое количество в пересчете на 1 г таблеток:

- общее число аэробных бактерий - не более 10³;

- общее число грибов - не более 10²;

- должны отсутствовать Enterobacteriaceae, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus.

Определение проводят по ОФС "Микробиологическая чистота". Масса исследуемых таблеток должна быть не менее 3 г. Таблетки в асептических условиях помещают в фарфоровую ступку с пестиком, растирают и суспендируют в 0,004 М стерильном фосфатно-цитратном буферном (ФЦБ) растворе Мак-Ильвейна в соотношении 1:10 (1 г в 10 мл).

Примечания.

1. Приготовление ФЦБ раствора Мак-Илвейна 0,004 М (pH 7,2-7,4). Готовят растворы 1 и 2.

Раствор 1: Лимонная кислота - 2,1 г; Вода очищенная - 100 мл.

Раствор 2: В мерной колбе вместимостью 1000 мл в воде очищенной растворяют 28,4 г натрия гидрофосфата безводного или 35,6 г натрия гидрофосфата дигидрата или 71, 6 г натрия гидрофосфата додекагидрата, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Смешивают 2 мл раствора 1 и 18 мл раствора 2 в мерной колбе вместимостью 1000 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Полученный раствор должен иметь pH 7,2-7,4. Если pH полученного раствора более 7,4, его доводят до нормы раствором 1. В случае, если pH полученного раствора меньше 7,2, приготовление раствора повторяют. Буферный раствор стерилизуют при температуре () °С и давлении () МПа в течение 8-30 мин (в зависимости от объема) или фильтруют через мембраны с диаметром пор 0,22 мкм и хранят при температуре от 2 до 8 °С. Срок хранения от 10 до 30 сут. в зависимости от способа укупорки флаконов (способ укупорки флаконов должен быть указан в нормативной документации).

Аномальная токсичность. Препарат должен быть нетоксичен для морских свинок массой 250-300 г и белых мышей массой 18-20 г при подкожном введении 1 и 1/25 прививочной дозы соответственно. Испытания проводят по ОФС "Аномальная токсичность".

Для определения токсичности используют не менее 4 таблеток. Таблетки растирают в стерильной ступке и суспендируют в 0,9% стерильном растворе натрия хлорида из расчета 5 мл на таблетку. После отстаивания в течение 45-60 мин вводят 5 мл надосадочной жидкости (по 2,5 мл в каждый бок) 2 морским свинкам и по 0,2 мл 5 беспородным белым мышам в холку. Наблюдение за животными проводят в течение 7 сут. В случае развития абсцесса или гибели хотя бы 1 животного производят повторный анализ на удвоенном количестве животных. Если при повторном анализе вновь регистрируются вышеперечисленные явления, серию препарата бракуют.

Специфическая активность. Одна прививочная доза препарата должна содержать не менее 1 · 10⁶ и не более 3 · 10⁷ ООЕ вируса вакцины.

Испытания проводят биологическим методом на ХАО 12-дневных КЭ от кур породы "Леггорн", "Роменбраун", "Родонит-2", "Изобраун" или "Хайсек", или пород кур, эмбрионы которых чувствительны к вирусу осповакцины. Объем выборки составляет не менее 7 прививочных доз (4 таблетки).

Куриные эмбрионы получают из хозяйств, свободных от вирусных и других возбудителей, патогенных для человека.

Подготовка КЭ. Проводят овоскопию КЭ в затемненном помещении. Каждый эмбрион просматривают в направленном пучке света. Свет должен падать сверху на тупой конец яйца. Яйцо с погибшим эмбрионом или с кровоизлиянием под оболочкой бракуют. В центре воздушного мешка на тупом конце яйца и на боковой поверхности яйца, на участке между сосудами и их ответвлениями карандашом делают отметку. В местах отметок с соблюдением правил асептики пропиливают бормашиной с абразивным диском отверстия (щели) длиной 3-4 мм и шириной 1,5 мм, не повреждая оболочки. Яйцо укладывают так, чтобы отверстие на боковой стороне было обращено вверх. Подскорлупную оболочку в центре воздушного мешка прорывают плоской полукруглой хирургической иглой. Затем на отверстие, расположенное на боковой поверхности, вносят 0,1 мл стерильного 0,004 М раствора ФЦБ Мак-Илвейна, подогретого до температуры () °С, и той же иглой осторожно продавливают подскорлупную оболочку. После этого практически вся капля раствора проходит под подскорлупную оболочку и частично отслаивает ХАО.

Из отверстия (в месте пропила) в центре воздушного мешка резиновой грушей осторожно отсасывают воздух до полного опускания ХАО. Яйца с опущенной ХАО помещают на лотки отверстием на боковой поверхности вверх и помещают в камеру с температурой () °С. Через 2 ч проводят овоскопию и бракуют эмбрионы с кровоизлияниями и воздушными мешками под ХАО или без воздушных мешков.

Приготовление десятикратных разведений. Таблетки взвешивают с точностью до 0,001 г, растирают в фарфоровой ступке и добавляют стерильный ФЦБ из расчета 10 мл на 1 г таблеток (соотношение 1:10 - "исходное разведение пробы"). В полученной взвеси дают отстояться грубым частицам в течение 45 мин. Из надосадочной жидкости пробы готовят 2 параллельных ряда последовательных десятикратных разведений. С этой целью отбирают по 0,5 мл испытуемого образца и вносят в 2 пробирки, содержащие 4,5 мл стерильного ФЦБ, получают разведение 10^-1. Содержимое пробирок перемешивают с помощью пипеток не менее 30 раз. Из каждой пробирки с разведением 10^-1 по 0,5 мл разведенного материала пипеткой переносят в последующую пробирку с 4,5 мл ФЦБ, не касаясь жидкости пипеткой, получают разведение 10^-2, и т.д. до разведения 10^-5, меняя пипетки после каждого разведения.

Примечание.

В используемый ФЦБ (раздел "Микробиологическая чистота") добавляют бензилпенициллин калия или натрия и стрептомицина сульфат из расчета 250 ед. активности каждого антибиотика в 1 мл ФЦБ.

Инфицирование КЭ. Для инфицирования КЭ используют разведения вакцины 10^-3, 10^-4 и 10^-5, предварительно объединенные из 2 параллельных рядов. Каждое разведение материала вводят на ХАО 15 КЭ по () мл в отверстие на боковой поверхности яйца. Круговым вращением яйца вирус равномерно распределяют по ХАО. Инокулированные эмбрионы инкубируют при температуре () °С в течение 42-48 ч. По окончании инкубации КЗ вскрывают, изолируют ХАО, промывают ее в воде, раскладывают на темном фоне и подсчитывают количество оспин на ХАО для каждого разведения. Из испытания исключают КЭ с поврежденной ХАО и погибшие.

Учет результатов. Вычисляют среднее арифметическое количество оспин на ХАО КЭ, инфицированных разведением вакцины, вызвавшим образование не менее 10 оспин (допускается расчет по максимальному разведению, содержащему не менее 80% таких КЭ).

Расчет специфической активности (А) в ООЕ проводят по формуле:

где: 10 - коэффициент исходного разведения пробы;

B - среднее арифметическое количество оспин на ХАО КЭ;

C - разведение исходной пробы;

d - объем инокулята, вводимого в КЭ;

e - количество таблеток (доз) в 1 г анализируемого образца.

Для определения чувствительности КЭ к вирусу вакцины параллельно с определением специфической активности на той же партии КЭ проводят определение специфической активности стандартного образца (СО) активности специфичности и некротической активности оспенной вакцины в соответствии с инструкцией по применению. На каждое разведение используют 15 КЭ.

Если полученная величина специфической активности СО отличается от указанной в паспорте, то вычисляют поправочный коэффициент (K_n) чувствительности данной партии КЭ к вирусу вакцины по формуле:

где: A_c - специфическая активность СО, указанная в паспорте, ООЕ/мл;

А₁ - полученная специфическая активность СО, ООЕ/мл.

Результаты определения специфической активности испытуемой серии препарата умножают на поправочный коэффициент K_n.

Упаковка и маркировка. В соответствии с ОФС "Иммунобиологические лекарственные препараты".

Транспортирование и хранение. При температуре от 2 до 8 °С.