Метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) предназначен для идентификации и контроля подлинности полисахаридных вакцин.

Спектроскопия ядерного магнитного резонанса - физический метод анализа, основанный на регистрации переходов между ядерными магнитными энергетическими уровнями молекул вещества, находящегося в постоянном магнитном поле. Переходы между ядерными магнитными уровнями возможны для ядер, обладающих ненулевым магнитным моментом, то есть для ядер со спиновым квантовым числом 1, не равным нулю. Практическое значение с точки зрения распространенности и чувствительности имеет наблюдение ЯМР на ядрах ¹Н, ¹³С, ¹⁵N, ¹⁹F и ³¹P. Все перечисленные магнитно-активные ядра имеют спин, равный 1/2. Набор переходов между всевозможными магнитными энергетическими состояниями магнитно активных ядер в молекуле составляет спектр ЯМР. Спектр ЯМР является характеристическим для каждого вещества и поэтому может применяться для его идентификации. На результирующий спектр ЯМР оказывают влияние условия регистрации: агрегатное состояние вещества, температура, наличие других веществ в анализируемом образце.

Основными характеристиками спектров ЯМР являются химический сдвиг, измеряемый в миллионных долях (м.д.), мультиплетность, интегральная интенсивность сигналов, а также константы спин-спинового взаимодействия, определяющие расщепление сигналов ЯМР и измеряемые в герцах (Гц). Эти характеристики зависят от химического окружения данного ядра или группы ядер, от типа и числа соседних ядер, обладающих магнитным моментом, от их пространственного расположения, а также от условий, в которых регистрируется спектр ЯМР,

С целью идентификации и контроля подлинности полисахаридных вакцин регистрируются спектры ЯМР на ядрах углерода 13 (ЯМР ¹³C) в контролируемых условиях. Спектроскопия ЯМР на ядрах ¹Н для образцов полисахаридов не является характеристической из-за сильного перекрывания сигналов.

Предварительно в датчике спектрометра ЯМР устанавливают температуру 35 °С. В случае исследования вязких растворов температура может быть увеличена до 70 °С. Перед началом регистрации спектра исследуемый образец выдерживают в датчике спектрометра для установления необходимой температуры не менее 5 мин. Для калибровки шкалы химических сдвигов спектрометра регистрируют спектр ЯМР ¹³C 20% раствора 1,4-диоксана в дейтерия оксида (D₂O). Химический сдвиг сигнала 1,4-диоксана устанавливают как 67,4 м.д. Спектры ЯМР ¹³C образцов полисахаридных вакцин регистрируют в тех же условиях.

Параметры регистрации спектров ЯМР ¹³C образцов полисахаридных вакцин:

Величина импульса: 45 °;

Спектральное разрешение: < 1 Гц/точка;

Время между импульсами: не менее 1 с;

Температура регистрации: 35 °С.

Параметры обработки спектров ЯМР ¹³C:

Взвешивающая функция: экспонента;

Параметр уширения взвешивающей функции: 2 Гц;

Коррекция базовой линии: полиноминальная.

Критерии пригодности спектров ЯМР ¹³C для анализа:

Отношение сигнал/шум: ;

Результирующая ширина спектральных линий: < 20 Гц.

Анализ спектров ¹³C образцов полисахаридных вакцин:

- выделяется спектральный диапазон аномерных атомов углерода 95-105 м.д.;

- в выделенном спектральном диапазоне идентифицируются характеристические сигналы для полисахаридов вакцины. Эти сигналы должны быть охарактеризованы определенными химическими сдвигами, уникальными для данного полисахарида, с соответствующими доверительными интервалами;

- в выделенном спектральном диапазоне определяется отсутствие других сигналов, не относящихся к полисахаридам вакцины;

- записывается ¹³C спектр, соответствующий спектральному диапазону аномерных атомов углерода, с указанием цифровых значений химических сдвигов всех характеристических сигналов. Также приводится запись полного спектра (0-210 м.д.) с указанием цифровых значений химических сдвигов характеристических сигналов.

Для идентификации и определения подлинности полисахаридной вакцины требуется одновременное выполнение условий как наличия всех характеристических сигналов с определенными химическими сдвигами, находящихся в границах доверительных интервалов, так и отсутствия любых других сигналов, не относящихся к целевому полисахариду.

Конкретный набор характеристических сигналов с соответствующими доверительными интервалами приводится в фармакопейной статье и нормативной документации.

Примечания.

1. Испытуемый образец. Образец массой от 10 до 20 мг (количество должно быть достаточным для регистрации спектра ¹³C, пригодного для анализа в соответствии с критерием пригодности по соотношению сигнал/шум) растворяют в 0,6 мл дейтерия оксида (D₂O) 99,9 ат.% D, раствор центрифугируют 20 мин. при 2000 об./мин. Надосадочную жидкость переносят в помеченную ампулу для регистрации спектров.

2. Раствор для калибровки. В ампулу для спектроскопии ЯМР помещают 480 мкл D₂O, добавляют 120 мкл 1,4-диоксана и перемешивают.