Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод количественного определения белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови человека (иммуноглобулинах, альбумине) и животных (антитоксических сыворотках) (Метод А) и на методику количественного определения белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом в препаратах крови животных (гетерологичные иммуноглобулины и антитоксические сыворотки), разведенных в 100 раз (Метод Б).

Методы основаны на взаимодействии в щелочной среде пептидных связей молекул белков с ионами двухвалентной меди (Cu²⁺) с образованием биуретового комплекса, окрашенного в фиолетовый цвет, интенсивность которого, измеряемая при длине волны 540 нм, прямо пропорциональна содержанию белка в препарате.

Колориметрический метод с биуретовым реактивом обладает низкой чувствительностью к посторонним веществам, которые могут присутствовать в качестве примеси в препарате.

К 5 мл испытуемого раствора, приготовленного из испытуемого образца с содержанием белка от 2 до 4 мг/мл, прибавляют 5 мл биуретового реактива для препаратов крови человека и животных, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. При тех же условиях аналогичным образом готовят стандартный раствор (СО). Испытуемые и стандартные растворы готовят в двух повторностях. Одновременно готовят контрольный раствор, используемый в качестве раствора сравнения, содержащий 5 мл 0,9% раствора натрия хлорида и 5 мл биуретового реактива. Измеряют оптическую плотность окрашенных растворов при длине волны 540 нм (если нет других указаний в нормативной документации) в кюветах с толщиной слоя 10 мм.

Содержание белка (X) в препарате в процентах вычисляют по формуле:

где:

А - значение оптической плотности раствора испытуемого образца;

Ао - значение оптической плотности СО;

Со - содержание белка в СО, в процентах.

Примечания

1. Испытуемый раствор (А). 1 или 2 мл испытуемого образца (в зависимости от исходного содержания белка) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора 0,9% раствором натрия хлорида до метки и перемешивают. Содержание белка в испытуемом растворе от 2 до 4 мг/мл.

2. Стандартный раствор (СО). Для препаратов иммуноглобулинов, альбумина и антитоксических сывороток используют соответствующие стандартные образцы, разрешенные к применению уполномоченными органами в соответствии с инструкциями по применению. Допускается использование стандартных образцов предприятия, аттестованных с использованием вышеуказанных стандартных образцов.

3. Биуретовый реактив для препаратов крови человека и животных. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 45 г калия-натрия тартрата, растворяют в 200 мл 0,2 М раствора натрия гидроксида, прибавляют 5 г меди (II) сульфата, затем прибавляют 5 г калия иодида и доводят объем тем же раствором натрия гидроксида до метки и перемешивают.

К 5 мл раствора испытуемого образца с содержанием белка в препарате от 0,8 до 1,3 мг/мл прибавляют 5 мл биуретового реактива для препаратов крови человека и животных, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Аналогичным образом готовят разведенный 1:100 стандартный образец (СО). Одновременно готовят контрольный раствор (см. приготовление по методу А). Испытуемые и стандартные образцы готовят в двух повторностях. Далее анализ проводят по методу А.

Содержание белка (X) в разведенном препарате 1:100 в процентах рассчитывают по формуле:

где:

Dисп. - значение оптической плотности испытуемого образца, разведенного 1:100;

Dсо - значение оптической плотности СО, разведенного 1:100;

Cсо - содержание белка в СО, в процентах.

Примечания

1. Разведенный стандартный образец. Используют соответствующие стандартные образцы (иммуноглобулина или антитоксической сыворотки), разрешенные к применению уполномоченными органами в соответствии с инструкциями по применению. 1 мл стандартного образца с содержанием белка от 80 до 160 мг/мл помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора 0,9% раствором натрия хлорида до метки и перемешивают. Допускается использование стандартных образцов предприятия, аттестованных с использованием вышеуказанных стандартных образцов.

2. Буретовый реактив для препаратов крови человека и животных (см. Примечания N 3 Метод А).