Настоящая фармакопейная статья распространяется на лекарственный препарат Первоцвета корневищ с корнями экстракт жидкий + Тимьяна обыкновенного травы экстракт жидкий, сироп, в качестве вспомогательных веществ содержит левоментол, метилпарагидроксибензоат и сахарозу. Препарат должен соответствовать требованиям ОФС "Сиропы" и ниже приведенным требованиям.

Содержит тимола не менее 3,0 мг и суммы примуловых кислот не менее 20,0 мг в 100,0 г сиропа.

Описание. Густая жидкость коричневого цвета с характерным запахом.

--------------------------------

<*> Допускается наличие опалесценции.

Подвижная фаза (ПФ). толуол - этилацетат (93:7).

Испытуемый раствор. 5,0 мл препарата помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в 7 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. 5,0 мл полученного раствора пропускают через колонку для твердофазной экстракции. Колонку промывают 4 раза по 2,5 мл смеси вода - метанол (9:1) под давлением. Осадок на колонке промывают 1,0 мл метанола без давления (или при минимальном давлении только в начале и в конце промывки). Используют элюат.

Подготовка колонки для твердофазной экстракции. Силикагель октадецилсилильным эндкепированный для колоночной хроматографии (С18), 55 - 105 мкм, 200 мг/3 мл, 50 р/К). Перед использованием колонку 2 раза ополаскивают 2 мл метанола и затем 2 раза по 2 мл смеси вода - метанол (9:1).

Раствор стандартного образца (СО) тимола. 3 мг СО тимола 3 растворяют в 25 мл метанола.

Срок годности раствора не более 1 мес при хранении в прохладном, защищенном от света месте.

Раствор для детектирования. Анисового альдегида раствор уксуснокислый в метаноле.

На линию старта ТСХ пластинки со слоем силикагеля F₂₅₄ в виде полос длиной 10 мм и шириной не более 2 мм наносят по 5 мкл испытуемого раствора и раствора СО тимола. Пластинку с нанесенными пробами сушат в течение 5 мин, помещают в камеру, предварительно насыщенную смесью растворителей толуол - этилацетат (93:7) в течение не менее 1 ч, и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет около 80 - 90% длины пластинки от линии старта, ее вынимают из камеры, сушат до удаления следов растворителей и обрабатывают анисового альдегида раствором уксуснокислым в метаноле. Пластинку выдерживают при температуре 100 - 105 °C в течение 5 мин до появления зон адсорбции.

На хроматограмме раствора СО тимола должна обнаруживаться оранжево-красная зона адсорбции.

На хроматограмме испытуемого раствора должны обнаруживаться зона адсорбции оранжево-красного цвета на уровне зоны адсорбции раствора СО тимола; допускается обнаружение других зон адсорбции.

Зона адсорбции на хроматограмме испытуемого раствора, полученного для количественного определения примуловых кислот, по положению и цвету должна соответствовать зоне адсорбции раствора СО примуловой кислоты 1.

Плотность. От 1,230 до 1,270 г/см³. В соответствии с требованиями ОФС "Плотность".

pH. От 4,0 до 6,0. В соответствии с требованиями ОФС "Ионометрия". Определение проводят непосредственно в препарате.

Масса содержимого упаковки. В соответствии с требованиями ОФС "Масса (объем) содержимого упаковки".

Микробиологическая чистота. В соответствии с требованиями ОФС "Микробиологическая чистота".

Тимол. Определение проводят методом газовой хроматографии.

Испытуемый раствор. Около 20,0 г препарата (точная навеска) помещают в коническую колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 10 мл воды, затем количественно переносят в делительную воронку вместимостью 500 мл, промывая коническую колбу 4 - 5 раз по 20 - 25 мл хлороформа. Хлороформ прибавляют в делительную воронку по стенке, избегая вспенивания.

В ту же делительную воронку прибавляют 1,0 мл раствора внутреннего стандарта. Экстрагируют медленно, совершая движения в одну сторону (при быстрой экстракции фазы могут не разделиться) в течение 5 мин. Хлороформную фазу отделяют и фильтруют через бумажный фильтр "черная лента" с 14 г натрия сульфата безводного, предварительно смоченные хлороформом, в круглодонную колбу вместимостью 500 мл. Фильтр промывают хлороформом. Экстракцию повторяют 2 раза по 70 мл хлороформа, смачивая бумажный фильтр хлороформом до и после каждого фильтрования. Промывают фильтровальную бумагу 15 мл хлороформа и соединяют все хлороформные фазы.

Объединенные хлороформные фазы выпаривают на роторном испарителе при температуре не более 40 °C досуха. Круглодонную колбу закрывают, охлаждают, осадок растворяют в хлороформе и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл (стенки колбы ополаскивают 3 - 4 раза хлороформом), доводят объем раствора хлороформом до метки и перемешивают.

Раствор внутреннего стандарта. Около 66 мг (точная навеска) стандартного образца (СО) камфоры помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 20 мл хлороформа, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Раствор плацебо. 31,7 г (точная навеска) плацебо (все составляющие препарата, кроме первоцвета корней экстракта жидкого, тимьяна травы экстракта жидкого и левоментола) помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, растворяют в 25 мл воды, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Стандартный раствор 1. Около 14 мг (точная навеска) стандартного образца (СО) карвакрола и около 7,6 мг (точная навеска) СО тимола помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в 5 мл хлороформа, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

Стандартный раствор 2. 20,0 мл раствора плацебо помещают в делительную воронку вместимостью 250 мл, прибавляют 10 мл воды и, по стенке делительной воронки, во избежание вспенивания, прибавляют 100 мл хлороформа. 1,0 мл стандартного раствора 1 и 1,0 мл раствора внутреннего стандарта помещают в ту же делительную воронку, экстрагируют, перемешивая в течение 5 мин, и далее раствор готовят аналогично приготовлению испытуемого раствора.

Контрольный раствор. 20,0 мл раствора плацебо помещают в делительную воронку вместимостью 250 мл, прибавляют 10 мл воды по стенке делительной воронки, во избежание вспенивания, прибавляют 100 мл хлороформа, экстрагируют, перемешивая в течение 5 мин, и далее раствор готовят аналогично приготовлению испытуемого раствора.

Хроматографируют испытуемый раствор, контрольный раствор и стандартный раствор 2.

Проверка пригодности хроматографической системы. Хроматографическая система считается пригодной, если для хроматограммы стандартного раствора 2 выполняются следующие условия:

- разрешение (R_S) между пиками тимола и пиком карвакрола должно быть не менее 2,0;

- фактор асимметрии (A_S) пиков тимола, камфоры и карвакрола должны быть не более 2,0%;

- относительное стандартное отклонение (RSD) площади пика тимола к площади пика внутреннего стандарта должно быть не более 2,0% (6 введений);

- эффективность хроматографической колонки (N), рассчитанная для каждого пика: тимол, камфора и карвакрол, быть не менее 3000 теоретических тарелок.

Относительные времена удерживания пиков: тимол - 1 (около 38 мин), камфора - около 0,9; карвакрол - около 1,01.

Содержания тимола в мг/100 г препарата (X) вычисляют по формуле:

где - площадь пика тимола на хроматограмме стандартного раствора 2;

S_t - площадь пика тимола на хроматограмме испытуемого раствора;

- площадь пика камфоры на хроматограмме стандартного раствора 2;

S_k - площадь пика тимола на хроматограмме испытуемого раствора;

a₀ - масса стандартного образца тимола, мг;

a - навеска препарата, г

P - фактическое содержание основного вещества в тимоле, %.

Примуловые кислоты. Определение проводят методом тонкослойной хроматографии с последующей денситометрией.

Пластинка. ВЭТСХ пластинка со слоем силикагеля F₂₅₄, 20 см x 10 см

Подвижная фаза (ПФ). Этилацетат - муравьиная кислота - вода (50:10:10).

Испытуемый раствор. Около 5,0 г (точная навеска) препарата помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 15 мл воды, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. 2,0 мл полученного раствора пропускают через колонку для твердофазной экстракции. Затем колонку промывают 4 раза по 2,5 мл смеси вода - метанол (9:1) при пониженном давлением. Смывы отбрасывают. Осадок на колонке промывают 4,0 мл метанола в колбу, не используя пониженное давление (пониженное давление применяют только в начале и в конце промывки). Используют элюат.

Подготовка колонки для твердофазной экстракции. Силикагель октадецилсилильным для колоночной хроматографии (С18), 55 - 105 мкм, 200 мг/3 мл, 50 р/К). Перед использованием колонку 2 раза ополаскивают 2 мл метанола и затем 2 раза по 2 мл смеси вода - метанол (9:1).

Раствор стандартного образца (СО) примуловой кислоты 1. 2,5 мг стандартного образца примуловой кислоты 1 помещают в мерную колбу вместимостью 10 мл, растворяют в 4 мл метанола, доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают.

1,0 мл полученного раствора переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл, доводят объем раствора метанолом до метки и перемешивают.

Раствор для детектирования 1. 5 мл серной кислоты концентрированной смешивают со 100 мл этанола.

Раствор для детектирования 2. 1 г ванилина смешивают со 100 мл этанола.

На линию старта высокоэффективной хроматографической пластинки на расстоянии 1,5 см от нижнего края пластинки полосами длиной 8 мм, расстояние между полосами 5 мм, скорость нанесения 3 сек/мкл наносят испытуемый раствор и раствор СО примуловой кислоты попеременно (14 нанесений на одной пластинке: 8 раз раствор СО примуловой кислоты и 6 раз испытуемый раствор) (таблица).

Пластинку с нанесенными пробами сушат в течение 5 мин, помещают в камеру, предварительно насыщенную в течение не менее 1 ч подвижной фазой этилацетат - муравьиная кислота - вода (50:10:10), и хроматографируют восходящим способом. Когда фронт растворителей пройдет 7,5 см от линии старта, пластину вынимают из камеры, высушивают при температуре 70 °C и еще горячую обрабатывают раствором для детектирования 1, затем раствором для детектирования 2. Пластинку нагревают при температуре 110 °C в течение 10 мин.

На хроматограмме раствора СО примуловой кислоты 1 в нижней трети пластинки должны обнаруживаться интенсивная зона адсорбции синевато-фиолетового цвета.

На хроматограмме испытуемого раствора должны обнаруживаться зона адсорбции синевато-фиолетового цвета на уровне зоны адсорбции примуловой кислоты 1; допускается обнаружение зоны адсорбции синевато-фиолетового цвета ниже зоны адсорбции примуловой кислоты 1 (примуловая кислота 2); допускается обнаружение других зон адсорбции.

Сухую пластинку регистрируют на денситометре при длине волны 540 нм (вольфрамовая или дейтерий-вольфрамовая лампа), щелевые размер 6,00 мм x 0,20 мм, скорость сканирования 10 мм/с, разрешение данных 100 м/шаг. Площади пиков просматривают в режиме интегрирования.

Уравнение калибровочной кривой для примуловой кислоты 1:

где S - средняя площадь пика компонента;

x - масса компонента/зона адсорбции, мкг;

a - наклон калибровочной кривой;

b - пересечение калибровочной кривой.

Массу примуловой кислоты 1/зона адсорбции испытуемого раствора (X_p1) в мкг вычисляют по формуле:

где S_p1 - площадь зоны адсорбции примуловой кислоты 1 испытуемого раствора;

a - наклон калибровочной кривой для примуловой кислоты 1;

b - пересечение калибровочной кривой для примуловой кислоты 1.

Содержание примуловой кислоты 1 в мг/100 г препарата (X₁) вычисляют по формуле:

где X_p1 - масса примуловой кислоты 1/зона адсорбции испытуемого раствора по показанию денситометра, мкг;

a - навеска препарата, взятого для приготовления испытуемого раствора, г.

Если на хроматограмме испытуемого раствора обнаруживается зона адсорбции, соответствующая примуловой кислоте 2, производят ее оценку относительно калибровочной функции примуловой кислоты 1. По шести измерениям вычисляют среднюю площадь пика примуловой кислоты 2 и подставляют в уравнение калибровочной кривой для примуловой кислоты 1.

Массу примуловой кислоты 2/зона адсорбции испытуемого раствора (X_p2) вычисляют по формуле:

где S_p2 - площадь зоны адсорбции примуловой кислоты 2 испытуемого раствора;

a - наклон калибровочной кривой для примуловой кислоты 1;

b - пересечение калибровочной кривой для примуловой кислоты 1.

Содержание примуловой кислоты 2 в мг/100 г препарата (X₂) вычисляют по формуле:

где X_p2 - масса примуловой кислоты 2/зона адсорбции испытуемого раствора по показанию денситометра, мкг;

a - навеска препарата, взятого для приготовления испытуемого раствора, г.

Если содержание примуловой кислоты 1 и примуловой кислоты 2 на пластинке составляет более 500 мкг, испытуемый раствор необходимо разбавить.

Содержание суммы примуловых кислот в мг/100 г препарата (X) вычисляют по формуле:

Хранение. В соответствии с требованиями ОФС "Хранение лекарственных средств".