ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО ДИАГНОСТИКЕ БОЛЕЗНИ ГАМБОРО
(утверждены 19 июля 1990 г., № 044-3)
1. Общие положения.
1.1. Лабораторная диагностика болезни включает:
- обнаружение антигена вируса болезни Гамборо в патологическом материале (фабрициевы сумки) в реакции диффузионной преципитации (РДП);
- выявление специфических антител в сыворотке крови переболевшей птицы в РДП;
- постановку биопробы на 30 - 40-дневных СПФ или чувствительных цыплятах;
- выделение вируса на СПФ-эмбрионах кур (КЭ) или в культуре куриных фибробластов (ФЭК);
- гистологическое исследование фабрициевых сумок больной или переболевшей птицы.
1.2. Диагноз на болезнь Гамборо устанавливают на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных с учетом результатов комплекса лабораторных исследований.
1.3. Для обследования птицехозяйства на болезнь Гамборо проводят серологические исследования, используя реакцию диффузионной преципитации (РДП). С этой целью в лабораторию направляют - 20 - 25 проб сывороток крови (1,0 - 2,0 см3) от цыплят суточных или старше 60-дневного возраста. Выявление специфических антител указывает на циркуляцию вируса в хозяйстве и дает основания для проведения лабораторных исследований патологического материала.
2. Подготовка материала к исследованию.
2.1. Для исследования в лабораторию направляют патологический материал (фабрициевы сумки) - 5 - 10 проб от больных цыплят 25 - 50-дневного возраста, который помещают в термос со льдом или консервируют 30 %-ным раствором глицерина на фосфатном растворе pH 7,2.
Для гистологического исследования патологический материал фиксируют 10 - 15 %-ным раствором формалина.
2.2. Отобранный патологический материал тщательно растирают в ступке со стерильным битым стеклом и готовят гомогенат на стерильном физиологическом растворе с pH 7,2 - 7,4 в соотношении 1:1.
После трехкратного замораживания и оттаивания центрифугируют при 5000 об/мин 20 - 25 мин. Надосадочную жидкость сливают и используют для исследования в РДП.
2.3. Для выделения вируса из фабрициевых сумок готовят 10 %-ную суспензию на физиологическом растворе, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 15 - 20 мин. К надосадочной жидкости добавляют 200 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Исследуемый материал выдерживают 12 ч при 48 °С, затем проверяют на стерильность и при отсутствии роста бактериальной микрофлоры в МПБ и МПА используют для заражения КЭ или культуры ФЭК или биологической пробы на цыплятах.
2.4. Для гистологического исследования из фабрициевых сумок готовят парафиновые срезы и окрашивают их гематоксилин-эозином общепринятым методом.
3. Постановка РДП.
3.1. При постановке РДП используют набор для диагностики болезни Гамборо.
Лиофилизированные препараты, входящие в набор, растворяют в 0,5 мл дистиллированной воды. Положительную сыворотку используют в рабочем разведении, которое на одно разведение меньше указанного на этикетке коробки титра сыворотки. Не использованные в течение дня растворы антигенов и сывороток можно перелить в стерильные пробирки, закрыть резиновой пробкой и хранить при температуре не выше 2 - 4 °С не более 14 сут.
3.2. Для приготовления агарового геля в колбе из термостойкого стекла в 100 мл дистиллированной воды растворяют 8,0 г хлорида натрия, затем добавляют 1,0 г агара «Дифко». Колбу выдерживают на кипящей водяной бане до полного расплавления и просветления агара и разливают в стерильные чашки Петри по 15 - 20 мл агара. После застывания агара вырезают лунки с помощью металлического пробойника (штампа) из семи жестко закрепленных трубочек диаметром 5 мм (одна в центре и шесть по переферии на расстоянии 5 мм). Агаровые пробки удаляют иглой, пинцетом или канюлей, соединенной с вакуумной установкой.
3.3. Для исследования патматериала в центральную лунку вносят положительную сыворотку в рабочем разведении, в две периферические, диаметрально противоположные лунки - положительный и отрицательный контрольные агенты, а в оставшиеся четыре - полученную по п. 2.2 надосадочную жидкость в объеме 0,05 мл.
Для каждой пробы антигена используют отдельную пастеровскую пипетку.
3.3.1. С целью, выявления антител в сыворотке в центральную лунку вносят специфический антиген, а в периферические - контрольные и исследуемые сыворотки в объеме 0,05 мл. Каждую сыворотку берут отдельной пастеровский пипеткой.
3.4. После заполнения лунок чашки Петри помещают во влажную камеру (термостат) при температуре (37,0 ± 0,5) °С.
3.5. Учет результатов РДП проводят через 24 и 48 ч после постановки реакции. Чашки просматривают на темном фоне в направленном луче света.
Реакцию учитывают только при наличии линии преципитации между сывороткой и антигеном в контроле.
За положительный результат при выявлении антигена принимают образование 1 - 2 линий преципитаций между лунками с исследуемым материалом и специфической сывороткой, а при выявлении антител - наличие линий преципитаций между лунками с исследуемой сывороткой и положительным антигеном.
4. Постановка биопробы на цыплятах.
4.1. Биопробу проводят на СПФ или 30 - 40-дневных цыплятах чувствительных к вирусу болезни Гамборо. Показатель чувствительности цыплят к данному возбудителю определяют с помощью индекса сумки (соотношение массы фабрициевой сумки к массе тела цыпленка).
Для определения указанного индекса из общей группы цыплят произвольно отбирают 5 - 10 голов, определяют вес каждого, затем их убивают, взвешивают от них фабрициевы сумки и вычисляют по формуле индекс сумки (Ис):
|
|
где Мс - масса фабрициевой сумки (г);
Мт - живая масса тела (г).
Цыплят, в группе которых индекс сумки 4 и выше, используют для проведения биопробы.
4.2. Суспензию исследуемого материала, приготовленную, как указано в п. 2.3, вводят по 0,5 мл перорально 5 цыплятам. В контроле одновременно содержат в аналогичных условиях незаряженных цыплят (5 гол.) одинакового возраста. За цыплятами устанавливают ежедневное наблюдение в течение 7 дней, отмечая клинические признаки заболевания.
4.3. За положительную биопробу принимают наличие у зараженных цыплят через 72 - 96 ч характерных клинических признаков заболевания: угнетение, отказ от корма, диарея, и патологоанатомических изменений - увеличение фабрициевой сумки, отечность, кровоизлияния.
5. Выделение вируса на куриных эмбрионах.
5.1. Для заражения используют СПФ-эмбрионы кур 10 - 11-суточной инкубации.
5.2. Приготовленным и проверенным на стерильность 10 %-ным (п. 2.3) гомогенатом заражают СПФ-куриных эмбрионов в объеме по 0,2 мл на хорионаллантоисную оболочку (ХАО). Зараженные эмбрионы помещают в термостат при температуре 37,5 °С и дважды в день овоскопируют. КЭ, погибшие в первые 48 ч после заражения, не учитывают (неспецифическая гибель). Эмбрионы, погибшие через 3 сут и позже и все оставшиеся живыми на 7-е сутки после заражения, охлаждают в холодильнике при 4 °С в течение 4 - 5 ч, затем их вскрывают и учитывают изменения эмбрионов. Характерными признаками для вируса болезни Гамборо являются наличие кровоизлияний в области головы, шеи, конечностей, отеки брюшной полости, а также отставание эмбрионов в росте, застойные явления в легких и разложение почек, печень увеличена, со множеством некротических очажков. ХАО у зараженных эмбрионов отечна и геморрагически воспалена.
5.3. При отсутствии специфических изменений у зараженных КЭ в первом пассаже проводят на СПФ-эмбрионах кур до 5 пассажей, используя для заражения суспензию из ХАО и эмбрионов предыдущего пассажа.
6. Выделение вируса на культуре клеток.
6.1. Для выделения вируса болезни Гамборо из патологического материала используют 24 - 48-часовую культуру первично трипсинизированных куриных фибробластов, которую готовят общепринятым методом и выращивают в стеклянных флаконах объемом 100 мл (матрасах). Для приготовления культуры клеток используют куриные эмбрионы из любого птицехозяйства.
В качестве питательной среды для культивирования клеток используют гидролизат лактальбумина, среду Игла или среду № 199. В ростовую среду добавляют 10 % сыворотки крупного рогатого скота. Поддерживающая среда состоит из тех же сред, но без сыворотки крупного рогатого скота.
6.2. Из полученной и обработанной 10 %-ной суспензии (согласно п. 2.3), свободной от контаминации микрофлорой, дополнительно готовят разведения суспензии на физиологическом растворе 10-2 и 10-3 и затем каждым разведением исследуемого материала в объеме по 3 мл заражают по 3 флакона с монослоем. Предварительно до заражения монослоя из матраса (флакона) удаляют ростовую среду и промывают раствором Хенкса. Зараженную культуру клеток выдерживают при температуре 37 °С в течение 30 мин, трижды промывают раствором Хенкса и затем добавляют поддерживающую среду. Для контроля культуры 2 - 3 матраса (флакона) оставляют незаряженными. Зараженные и контрольные флаконы инкубируют при 37 - 38 °С.
6.3. Для учета цитопатического действия (ЦПД) флаконы просматривают под малым увеличением микроскопа через каждые 24 ч в течение 7 дней.
Цитопатическое действие (ЦПД) вируса болезни Гамборо наступает через 48 - 96 ч и характеризуется появлением отдельных округлых и изогнутых клеток, или очагов дегенерации, состоящих из округлых, слегка увеличенных в размере и преломляющих свет клеток на фоне сохранявшего целостность монослоя. Через 48 - 72 ч 80 % клеток монослоя имеют зернистость.
При наличии ЦПД проверяют его специфичность путем нейтрализации действия вируса положительной сывороткой к вирусу болезни Гамборо (по общепринятой методике).
При отсутствии ЦПД вируса в первом пассаже проводят еще четыре последовательных пассажа. Если ЦПД в течение 4 пассажей не проявилось, результат считают отрицательным.
7. Гистологическое исследование.
7.1. При микроскопическом исследовании гистосрезов в фабрициевой сумке на ранней стадии заболевания цыплят болезнью Гамборо отмечают отек межфолликулярной соединительной ткани, инфильтрацию ее мононуклеарными клетками и псевдоэозинофилами, очаговые или диффузные кровоизлияния, иногда тотальный или фибринозный бурсит. В фолликулах фабрициевых сумок наблюдают некроз лимфоцитов. Отдельные фолликулы заполняются клеточным детритом или инфильтрированы псевдоэозинофилами.
Реже обнаруживают коагуляционный некроз мозговой и корковой зон фолликулов с макрофагальной реакцией по периферии.
У переболевших цыплят отмечают увеличение количества стромы, атрофию складок и частичное или полное отсутствие фолликулов фабрициевых сумок, вместо которых образуются железистые структуры. Также выявляют «псевдофолликулы», сформированные в основном ретикулярными клетками, реже кистозные полости, равные по размерам фолликулам или превышающие их в 2 - 3 раза. Встречают регенерирующие фолликулы с пролиферацией лимфоцитов в корковом слое фолликула с последующим восстановлением структуры мозгового слоя. В соединительнотканной строме складок слизистой оболочки отмечают периваскулярные лимфоидноклеточные пролифераты, из которых затем формируются новообразованные фолликулы.
8. Сроки исследований.
Выделение вируса на КЭ и КК - 10 - 50 дней.
Постановка РДП - 3 дня.
Биологических - 15 дней.
Гистологических - 7 - 10 дней.
КРАТКИЙ СЛОВАРЬ
ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ВЕТЕРИНАРНЫХ ТЕРМИНОВ
Антигены (анти + греч. genes - порождающий) - чужеродные для организма высокомолекулярные органические вещества коллоидной структуры (белки, белково-липидные и белково-полисахаридные комплексы), способные при поступлении (введении парентерально) вызывать синтез особых глобулинов-антител и вступать в специфическое взаимодействие с ними.
Антитела (анти. + тело) - противотела - специфические белки (иммуноглобулины), образующиеся в организме под воздействием антигенов. Они накапливаются в сыворотке крови и тканях, вступают в специфическую связь с соответствующими антигенами и разрушают или обезвреживают их.
Биологическая проба (биопроба) - один из методов диагностики инфекционных болезней с помощью заражения патологическим материалом подопытных животных (куриных эмбрионов, культур клеток) и их исследования.
Вирион - полноценная внеклеточная вирусная частица.
Вирусовыделение - выделение возбудителей инфекции из организма больного животного или вирусоносителя.
Вирусоносительство - наличие возбудителя инфекции в определенных органах и тканях клинически здорового животного, не сопровождающееся иммунологической перестройкой организма.
Вирусы (лат. virus - яд) - облигатные внутриклеточные паразиты, отличающиеся от растительных и животных организмов малыми размерами, отсутствием клеточного строения и автономного метаболизма, наличием только одного типа нуклеиновой кислоты и дезъюнктивным способом размножения.
В. безоболочечные - вирусы, в структуре которых отсутствует липопротеидная оболочка.
В. оболочечные - вирусы, в структуре которых присутствует липопротеидная оболочка.
Вирусоскопия (вирусы + skopeo - смотрю, наблюдаю) - метод микроскопического изучения морфологии вирусов.
Гемагглютинация (греч. haima - кровь + agglutinatio - склеивание) - склеивание и выпадение в осадок эритроцитов под воздействием вирусов, бактерий, токсинов и др., способных адсорбироваться на поверхности эритроцитов, а также гемагглютининов.
Гемадсорбция (греч. haima - кровь + adsorbtio - поверхностное поглощение) - способность культур клеток, зараженных вирусами, адсорбировать эритроциты различных животных, что объясняется включением в плазматическую мембрану синтезирующихся вирусных белков.
Диагностика (греч. diagnostikos - способный распознавать) - раздел клинической ветеринарии о методах исследования животных для распознавания их болезней и состояния организма с целью назначения необходимого лечения и профилактических мероприятий.
Диагностический набор - набор стандартных препаратов, используемых для постановки диагноза (антиген, специфическая и контрольная сыворотки и др.).
ДНК-зондов метод - метод генодиагностики, основанный на способности меченой одноцепочечной молекулы ДНК взаимодействовать с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты определенного вируса с образованием двухцепочечной структуры.
ДНК-содержащие вирусы - вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты - ДНК, у большинства она представлена двухцепочечной структурой, у некоторых - одной цепью.
Идентификация (лат. identifico - отождествляю) - признание тождественности, опознание-определение видовой (типовой) принадлежности микроорганизма на основании всестороннего изучения его свойств.
Иммуноферментный анализ - группа методов, позволяющих выявлять комплекс антиген - антитело с помощью субстрата, который расщепляется ферментом (пероксидазой, щелочной фосфатазой и др.) с появлением окрашивания.
Инактивация вирусов (лат. inactivus - неактивный) - уничтожение инфекционной активности вирусов путем повреждения генома физическим или химическим воздействием.
Индикация возбудителя инфекции (лат. indicatio - указание) - выявление и идентификация патогенных микроорганизмов в различных объектах.
Инокуляция возбудителя (лат. inoculatio - прививка) - введение возбудителя путем инъекции (искусственное заражение или внесение его в организм животного членистоногими переносчиками при укусах).
Консервирование вирусов (лат. conservare - сохранять) - общее название методов воздействия физическими и (или) химическими факторами на какие-либо объекты с целью длительного сохранения в них вирусов.
Контаминация (лат. contaminatio - смешение) - обсеменение поверхности тела животного, предметов ухода, почвы, воды, кормов, биопрепаратов и других объектов патогенными микроорганизмами.
Культивирование вирусов - выращивание вирусов в искусственных условиях.
Культуры клеток (клеточные культуры) - клетки многоклеточного организма, живущие вне его в искусственно созданных условиях среды.
Куриный эмбрион - оплодотворенное куриное яйцо, выдержанное в инкубаторе.
Лабораторные животные - животные, используемые в лабораториях при проведении исследований (мыши, крысы, кролики, морские свинки, хомяки, голуби и др.).
Лиофилизация (греч. lyo - растворяю + phileo - люблю) - высушивание предварительно замороженного материала в глубоком вакууме.
Моноклональные антитела - строго специфические антитела, способные выявить минимальные различия в химическом составе и пространственной конфигурации молекул, являются продуктом отдельных клонов антителопродуцирующих клеток.
Парные сыворотки - сыворотки, взятые в самом начале заболевания и 2 - 3 недели спустя. Повышение титра антител в 4 раза и более считается основой положительной реакции.
Пассаж (фр. passage - переход) - последовательное заражение восприимчивых объектов (животные, куриные эмбрионы, культуры клеток) микроорганизмами.
Полимеразная цепная реакция (от англ. Polymerase Chain Reaction, ПЦР) - метод генодиагностики, основанный на многократном увеличении копий строго определенных фрагментов молекулы ДНК вируса при помощи фермента термостабильной ДНК-полимеразы.
Реакция гемагглютинации (РГА) - метод обнаружения и идентификации вирусов, основанный на способности многих вирусов, обладающих тканевым тропизмом, агглютинировать эритроциты определенных видов животных.
Реакция иммунофлуоресценции (РИФ) (лат. fluorescens - светящийся) - серологическая реакция, основанная на взаимодействии антиген - антитело, при этом один из компонентов, участвующий в реакции, связан с флуоресцирующим красителем.
Реакция нейтрализации (PH) - метод идентификации вируса, основанный на феномене потери им инфекционности в результате взаимодействия со специфическими антителами.
Реакция связывания компемента (РСК) - метод серологического исследования, основанный на способности образующегося комплекса антиген - антитело связывать комплемент, что выявляется по отсутствию гемолиза при добавлении гемолизина и эритроцитов.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) - метод идентификации вируса или выявления противовирусных антител в сыворотке крови, основанный на феномене отсутствия агглютинации эритроцитов вирусом, в присутствии специфических к нему антител.
РНК-содержащие вирусы - вирусы, имеющие один тип нуклеиновой кислоты - РНК, у большинства она представлена одной цепью, у некоторых - двухцепочечной структурой.
Серовариант - самостоятельная группа внутри определенного вида и серогруппы (серотипа) микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида и серогруппы (серотипа), что выявляется с помощью серологических реакций.
Серогруппа (серотип) - самостоятельная группа внутри определенного вида микроорганизмов, обусловленная наличием антигенов, отличающихся от антигенов других микроорганизмов этого вида, что выявляется с помощью серологических реакций.
Серологические реакции - реакции, широко используемые при постановке диагноза инфекционных болезней, методы обнаружения антител и антигенов в крови и других тканях.
Сыворотка крови (лат. serum - сыворотка + sanguis - кровь) - составная часть крови, представляющая собой плазму, из которой удалены форменные элементы и фибрин в процессе свертывания крови.
Тельца включения - своеобразные морфологические образования, обнаруживаемые в цитоплазме или ядрах клеток определенных тканей при некоторых вирусных инфекциях и состоящие из скопления вирионов и вирусных белков.
Термолабильность (греч. thermos - теплый + лат. labilis - нестойкий) - неустойчивый к тепловому воздействию, изменяющийся при нагревании.
Термостабильность (греч. thermos - теплый + лат. stabilis - неизменный) - сохраняющий свои свойства при нагревании.
Титр вируса - концентрация инфекционных единиц вируса в определенном объеме материала.
Цитопатогенное действие вирусов (ЦПД, цитопатический эффект) - специфическая морфологическая деструкция (разрушение) и функциональная патология зараженных вирусами клеток в культурах.
Штамм (нем. stamm - род, корень) - культура микроорганизмов одного вида с одинаковыми морфологическими и биологическими свойствами.
Элементарные тельца - см. Вирион (2, 3).