Государственное санитарно-эпидемиологическое нормирование
Российской Федерации

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации
Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258
в воздухе рабочей зоны

Методические указания
МУК 4.2.3433-17

Москва 2017

1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (Н.И. Шеина).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 февраля 2017 г.

4. Введены впервые.

СОДЕРЖАНИЕ

1. Назначение и область применения. 2

2. Биологическая характеристика штамма Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 и его гигиенический норматив в воздухе рабочей зоны.. 2

3. Пределы измерений. 3

4. Методы измерений. 3

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.. 3

5.1. Средства измерений. 3

5.2. Вспомогательные устройства. 3

5.3. Реактивы и питательные среды.. 4

6. Требования безопасности. 4

7. Требования к квалификации операторов. 5

8. Условия измерений. 5

9. Приготовление питательных сред. 5

10. Проведение измерения. 5

10.1. Отбор проб воздуха. 5

10.2. Выполнение анализа. 5

11. Вычисление результатов измерения. 6

12. Оформление результатов измерений. 6

 

 

УТВЕРЖДАЮ

Руководитель Федеральной службы
по надзору в сфере защиты прав
потребителей и благополучия человека,
Главный государственный санитарный
врач Российской Федерации

_______________________ А.Ю. Попова

22 февраля 2017 г.

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Микробиологическое измерение концентрации
Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258
в воздухе рабочей зоны

Методические указания
МУК 4.2.3433-17

1. Назначение и область применения

1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м3 воздуха.

1.2. Методические указания носят рекомендательный характер.

2. Биологическая характеристика штамма Beijerinckia
fluminensis
Bf 2806 ВКПМ В-12258 и его гигиенический
норматив в воздухе рабочей зоны

Штамм Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 выделен из окультуренных почв методом многоступенчатой аналитической селекции, не является генетически модифицированным штаммом. Штамм предполагается использовать для производства биоудобрений в растениеводстве. Активность производственного штамма не менее 5×106 кл./мл.

Таксономическое положение штамма

Царство

Bacteria

Подцарство

Proteobacteria

Класс

Alphaproteobacteria

Порядок

Rhizobiales

Семейство

Beijerinckiaceae

Род

Beijermckia

Вид

fluminensis

Штамм

Bf2806

Культурально-морфологические особенности штамма: на среде Федорова штамм образует круглые, выпуклые, непрозрачные, бесцветные, слизистые колонии диаметром 2,0 - 4,0 мм, гладкие с ровным краем, тягучей консистенции. На агаризованной среде Бэрка - блестящие голубоватые колонии.

При микроскопировании через 18 ч при температуре 28 - 30 °С можно видеть мелкие подвижные палочковидные клетки 1,0×2,0 мкм, длина варьирует вплоть до кокковидиой формы. В зрелой культуре через 48 ч роста наблюдаются мелкие укороченные палочки, в основном одиночно расположенные. Эндоспор не образует. Клетки подвижны, имеют перитрихиальные жгутики. Грамотрицательные, каталазоположительные, непротеолитические, но могут использовать нитрат, аммиак и аминокислоты как источники азота, а крахмал и манит в качестве источников углеводов.

Штамм Beijernickia fluminensis Bf 2806 не является зоо- и фитопатогенным, не относится к микроорганизмам, патогенным для человека (СП 1.3.2322-08), депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-12258.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 50000 кл/м3.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Методы измерений

Прямой метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений бактерий на среду Федорова и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,
реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.

5.1. Средства измерений

Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 - 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности ±2,5 мм рт. ст.

ТУ 2504-1799-75

Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности ±0,2 мг

ГОСТ Р 53228-08

Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2

ГОСТ 1770-74

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3

ГОСТ 29227-91

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3

ГОСТ 1770-74

Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 - 55 °С

ТУ 25-2021.003-88

Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха

 

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

5.2. Вспомогательные устройства

Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 ± 5) °С

ТУ 9452-010-00141798-02

Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28 ± 2) и (37 ± 2) °С

ТУ 9452-002-00141798-97

Автоклав электрический

ГОСТ 9586-75

Стерилизаторы паровые медицинские

ГОСТ Р ЕН 13060-11, ГОСТ Р 51935-02

Дистиллятор

ТУ 4952-007-33142130-2000

Облучатель бактерицидный настенный

ТУ 9444-015-03965956-08

Холодильник бытовой

ГОСТ 26678-85

Микроскоп биологический с иммерсионной системой и материалы

 

Лупа с увеличением ×10

ГОСТ 25706-83

Пробирки типов П1, П2

ГОСТ 25336-82

Спиртовки лабораторные стеклянные

ГОСТ 23932-90

Чашки биологические (Петри)

ГОСТ 23932-90

Воронки конусные диаметром 40 - 45 мм

ГОСТ 25336-82

Груша резиновая

ТУ 9398-005-0576-9082-03

Петля бактериологическая

 

Марля медицинская

ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая

ГОСТ 25556-81

Бумага фильтровальная лабораторная

ГОСТ 12026-76

Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

5.3. Реактивы и питательные среды

Агар микробиологический

ГОСТ 17206-96

Аммоний молибденовокислый, хч

ГОСТ 3765-78

Вода дистиллированная

ГОСТ 6709-90

Железо сернокислое, хч

ГОСТ 6981-94

Калий однозамещенный фосфорнокислый, хч

ГОСТ 4198-75

Кальций углекислый, хч

ГОСТ 4530-76

Кислота борная, хч

ГОСТ 18704-78

Магний сернокислый, хч

ГОСТ 4523-77

Марганец сернокислый 5-водный, чда

ГОСТ 435-77

Меласса свекловичная

Р 52304-2005

Натрий хлористый, хч

ГОСТ 4233-77

Спирт этиловый ректификованный

ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87

Спирт этиловый технический

ГОСТ 17299-78

Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристикам.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток в воздухе рабочей зоны соблюдают требования, изложенные в следующих документах:

6.1. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней»: СП 1.3.2322-08.

6.2. Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08: СП 1.3.2518-09.

6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:

- температура воздуха (20 ± 5) °С;

- атмосферное давление (760 ± 20) мм рт. ст.;

- влажность воздуха не более 80 %.

9. Приготовление питательных сред

Для приготовления агаризованной среды Федорова смешивают указанные компоненты (г/дм3: калий однозамещенный фосфорнокислый - 0,5 г, магний сернокислый - 0,3 г, натрий хлористый - 0,3 г, железо сернокислое - 0,005 г, марганец сернокислый - 0,005 г, аммоний молибденовокислый - 0,005 г, борная кислота - 0,005 г, кальций углекислый - 3,5 г, меласса - 30,0 г, агар-агар - 17,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1,0 дм3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

Смесь нагревают до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 121 °С в течение 15 мин и охлаждают до 60 °С. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 - 500 см3 и автоклавируют при 121 °С в течение 15 мин.

Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °С в течение 14 дней, не более.

10. Проведение измерения

10.1. Отбор проб воздуха

Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением № 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96. «ГСИ. Методики выполнения измерений».

Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависят от предполагаемой концентрации микроорганизма.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96 %-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

10.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (среда Федорова) расплавляют, остужают до 50 - 60 °С и разливают в чашки Петри.

Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °С не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре 2 - 8 °С не более 10 дней.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 ± 2) °С. Через 1 - 2 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.

Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 высевается на 2 - 3 чашки используемой среды.

Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 - 3 пассажа во избежание потери заданных ей ростовых свойств.

11. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток проводят по формуле:

K - концентрация Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 в воздухе, кл/м3;

П - количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;

1000 - коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;

С - скорость аспирации воздуха, л/мин;

Т - время аспирации, мин.

12. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.

Протокол № _____
количественного микробиологического анализа Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ В-12258 в воздухе рабочей зоны

1. Дата проведения анализа ___________________________________________________

2. Рабочее место (профессия работающего) ______________________________________

3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая

стадия, точка отбора пробы) __________________________________________________

4. Вид пробоотборника _______________________________________________________

5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб __________

6. Питательная среда, время инкубации _________________________________________

7. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды _____________________

8. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) __________________________________________________________

9. Результаты идентификации микроорганизмов Beijerinckia fluminensis Bf 2806 ВКПМ

В-12258 (морфологические признаки) __________________________________________

10. Результаты расчета концентрации штамма ___________________________________

1 1. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКв.р.з. ____________________

12. Отбор пробы проведен (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ____________________

13. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф. И. О., должность, дата, подпись) ______________________________________________________________