Методические указания по диагностике нозематоза медоносных пчел
(утв.
Главным управлением ветеринарии
Министерства сельского хозяйства СССР 25 апреля 1985 г. № 115-6А)
1.1. Нозематоз - инвазионная болезнь пчелиных семей, вызываемая микроспоридией Nosema apis. Болезнь характеризуется ослаблением пчелиных семей, снижением их продуктивности и гибелью пчел.
Наиболее остро (с клиническими признаками) болезнь проявляется в апреле-мае и значительно слабее (асимптомно) - в конце августа - начале сентября.
1.2. Диагноз на нозематоз ставят на основании клинических, эпизоотологических и лабораторных данных.
1.3. Для исследования в ветеринарную лабораторию посылают пробы по 50 - 100 живых пчел от семьи или свежий подмор от 10 - 20 % пчелиных семей, имеющихся на пасеке, погибшую матку, а также фекалии от пчел; 5,0 г меда, 0,5 г перги или пыльцевой обножки, смывы с листов вощины.
1.3.1. Для прижизненной диагностики нозематоза матки ее осторожно помещают под стеклянный колпак, на дно которого кладут стеклянную пластинку или целлофан. Постланный материал с испражнениями матки сушат и отправляют в лабораторию.
1.3.2. Сбор фекалий пчел проводят весной перед их массовым облетом. С этой целью на передней стенке улья укрепляют на 1 - 1,5 часа лист белой бумаги (размером 20×30 см) с обозначением номера улья. Фекалии со стенок улья или рамок собирают путем их соскоба с поверхностей.
1.3.3. Пробы меда отбирают непосредственно из семей пчел путем вскрытия ячеек или из среднего и низшего слоя этого продукта, хранящегося в таре.
1.3.4. Пробы перги берут из сотов чистым шпателем, а пыльцевую обножку отбирают из пыльцеуловителей.
1.3.5. Для исследования вощины из разных мест пачки отбирают по 5 листов, с обеих поверхностей которых делают смывы, расходуя на каждый лист по 50 мл воды. Смывы собирают в чистые флаконы.
2.1. При исследовании пчел от них отделяют брюшки в мерный цилиндр. К пробе пчел добавляют воду по 1 мл на пчелу, содержимое тщательно растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством песка (стекла) или в гомогенизаторе до получения суспензии. Каплю полученной суспензии помещают на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют в затемненном поле микроскопа.
Исследуют до 20 полей при увеличении 400 - 600 раз. При наличии спор ноземы видны овальные, преломляющие свет тела. Степень поражения пчел ноземой оценивается в крестах: до 10 спор - один крест, до 100 - два, до 1000 - три и свыше 1000 - четыре креста.
2.2. Погибшую пчелиную матку считают как пробу от семьи. Ее исследуют индивидуально, гомогенизируя с 1 мл воды. При обнаружении под микроскопом спор ноземы в гомогенате, независимо от их количества в поле зрения, степень инвазии оценивается в четыре креста.
2.3. Для определения количества спор в пробе ведут подсчет их в 5 больших или 80 гладеньких квадратах камеры Горяева. Зная объем камеры, общий объем пробы и число пчел вычисляют количество спор на одну пчелу.
2.4. Фекалии осторожно снимают скальпелем со стеклянных пластинок, целлофана или бумаги на предметное стекло, добавляют 1 - 2 капли воды, тщательно размешивают препаровальной иглой до получения однородной массы, накрывают покровным стеклом и исследуют под микроскопом.
2.5. К 2,1 г (1,5 мл) меда добавляют 5 мл воды и 10 мл этилового спирта, тщательно размешивают и центрифугируют при 2500 - 3000 об/мин 5 - 10 мин, полученный осадок исследуют под микроскопом.
2.6. 250 мг перги или пыльцевой обножки наносят на предметное стекло, добавляют 3 - 5 капель воды (лучше раствор Люголя), тщательно растирают и исследуют под микроскопом.
2.7. Смывы с листов вощины разливают в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют 10 мин при 2500 - 3000 об/мин, полученный осадок исследуют под микроскопом.
2.8. С целью дифференциации спор ноземы используют контрастные методы окраски. Мазки фиксируют в метиловом спирте (5 - 10 мин) или спирт-эфире (15 - 20 мин) и подвергают воздействию 10 - 30 % перекиси водорода в течение 14 часов. Затем ополаскивают водой и красят азокармином в течение 7 часов при комнатной температуре или 2 часов при 56 °С. Исследования проводят под увеличением 400 - 600 раз или иммерсионной системой микроскопа. Зрелые споры микроспоридий не окрашиваются, выгладят в виде вытянутых образований с закругленными концами.
2.9. Для выявления стадий развития возбудителя используют препараты-отпечатки со средней кишки или гистологические срезы этого органа. После фиксации препараты окрашивают по Романовскому-Гимза, Циль-Нильсену и другими красителями.
2.10. Для определения жизнеспособности спор их окрашивают водным раствором акрицина-оранжевого в разведении 1:20000 - 1:25000. Препараты промывают дистиллированной водой и исследуют под люминесцентным микроскопом (светофильтры: ФС-1-2, ФС-1-4, СЗС-24 или СЗС-14, БС-8-2, запирающий фильтр ЖС-18, окуляры 8×, 10×, объектив ×90. Сила тока при микроскопировании 4, 0-4, 5А). Живые споры светятся ярко-зеленым, а погибшие - медно-красным цветом.
2.11. Видовую принадлежность спор нозем определяют непрямым методом реакции иммунофлуоресценции (РИФ).
Подсушенные на воздухе мазки-отпечатки из средней кишки или гомогената пчел фиксируют в течении 30 мин спирт-эфиром (1:1). На мазок наносят несколько капель иммунной сыворотки (цельной или разведенной 1:10). Препараты помещают на 1 час во влажную камеру при 37 °С и после этого в течение 30 мин промывают в 0,15 М растворе NaCl (pH 7,2 - 7,4), (иммунные сыворотки к Nosema apis пчел готовит ВИЭВ).
На подсушенные препараты наносят по 1 - 2 капле антивидовой люминесцирующей сыворотки (готовит ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи), выдерживают во влажной камере при 37 °С в течение 1 часа и промывают 30 мин физиологическим раствором (pH 7,2 - 7,4), при этом дважды меняют раствор. После просушки на мазок наносят каплю нефлуоресцирующего иммерсионного масла или диметилфталата и исследуют под люминесцентным микроскопом (см. пункт 2.10).
Реакцию считают положительной при наличии ярко-зеленой люминесценции оболочек спор Nosema apis.
В контрольных мазках, обработанных нормальной сывороткой вместо иммунной, свечения не наблюдается; в мазках, содержащих искомый антиген N. apis (готовит ВИЭВ) реакция должна быть положительной.
СОДЕРЖАНИЕ